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在三个实验区和三个缓冲区顶部以及传送窗内部安装有紫外灯,供消毒用。
在试剂准备区和标本制备区还设置移动紫外线灯,对实验桌进行局部消毒。
4、机械连锁不锈钢传递窗:
试剂和标本通过机械连锁不锈钢(不建议使用电子连锁方式)传递窗传递,保证试剂和标本在传递过程中不受污染(人物分流)。
5、地面
地面建议使用pVc卷材地面或自流坪地面,整体性好。
便于进行清扫,耐腐蚀。
没有条件的也可采用水磨石地面,或大块的瓷砖(至少800mm×
800mm)接缝需要小于2mm。
6、照明
灯具要选用净化灯具,能达到便于清洗、不积尘的特点。
标准的pcR实验室在建设的过程中应注意:
●规范的安装流程和全面的服务流程。
●严格按照规范科学设计的安装流程。
●安装前需要确定以下安装条件,如:
电源电压,电源进线位置,电话网络线进线位置,进水水压,最小安装空间,地面平整度,通风孔、进水管和下水管的位置等,理想状态的空间尺寸和通风口尺寸。
2.1pcR实验室依据所使用的方法可分为试剂准备、标本制备、扩增、产物分析等三或四个区域。
只是使用实时荧光pcR仪、hiV病毒载量测定仪的pcR实验室,有上述前面三个区域即可。
各区域应完全独立分隔,不应有任何的空气直通。
2.2标准的pcR实验室产物分析区或三个区域的最后一个区域(即扩增及产物分析区),空气流向应由室外向室内,可通过在室内设置通风橱、排风扇或其他排风系统达到空气流由室外向室内流动的要求。
2.3pcR实验室各区域仪器设备配备通常如下:
2.3.1标准的pcR实验室试剂准备区:
仪器设备主要应有加样器、冰箱、天平、低速离心机、混匀器、可移动紫外灯等。
可使用超净工作台作为试剂配制操作台面。
2.3.2标准的pcR实验室标本制备区
仪器设备主要应有生物安全柜(最好为b2,可避免提取核酸在柜内反复循环,造成标本间交叉“污染”,出现假阳性结果。
此外还应配备加样器、台式高速离心机(冷冻及常温)、台式低速离心机、恒温设备(水浴和/或干浴仪)、冰箱、混匀器和可移动紫外灯等。
2.3.3标准的pcR实验室扩增区
主要仪器就是核酸扩增热循环仪(pcR仪,实时荧光或普通的)。
热循环仪的电源应专用,并配备一个稳压电源或ups,以防止由于电压的波动对扩增测定的影响。
此外,根据工作需要,还可配备加样器、超净台等。
2.3.4标准的pcR实验室产物分析区:
本区所使用的仪器设备可能有加样器、电泳仪(槽)、电转印仪、杂交炉或杂交箱、水浴箱、dna测序仪、酶标仪和洗板机等。
在理想情况下,pcR实验室试剂准备、标本制备、扩增三个区域可设置缓冲间。
在缓冲间内,可设置正压,使室内空气不流向室外,室外空气不流向室内。
pcR实验室平面布置示意图
一般实验室间隔材料分:
彩钢板,不锈钢板,理化板等,价格依次而上,
主要考虑不产尘,不滋菌,容易清理就行
**卫生部pcR研究员李金明(卫生部临床检验中心临床免疫室主任,研究员)的pcR建设方案再说吧!
国外的资料不一定是最好。
个人觉得李金明的实验室区正压(扩增分析区因为没有缓冲,所以为负压),缓冲间负压的作法可以更好的防止气体的外泄及防止试剂准备区、标本制备区、产物扩增区、扩增分析区四区之间的气体相互渗漏。
pcR实验室也可以分为三个区,即第三、四区合为一区,必须设立缓冲间。
有条件建设实验室采用三十万级的标准来建设。
空调系统采用制冷剂各区独立循环,可以防止气流交叉。
**疾病预防控制中心实验室建设之pcR实验室基本要求:
pcR实验室可以是分散形式,也可以是组合形式。
完成一组pcR实验,通常应经过试剂配制、样品处理、核酸扩增及产物分析四个实验过程,若实验工艺需要,还应增加样品粉碎过程。
篇二:
标准的pcR反应体系
标准的pcR反应体系
pcR反应体系与反应条件
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标准的pcR反应体系:
10×
扩增缓冲液10ul
4种dntp混合物各200umoll
引物各10~100mol
模板dna01~2ug
tqdna聚合酶25u
g2+15mmoll
加双或三蒸水至100ul
pcR反应五要素:
参加pcR反应的物质主要有五种即引物、酶、dntp、模板和g2+引物:
引物是pcR特异性反应的关键,pcR产物的特异性取决于引物与模板dna互补的程度。
理论上,只要知道任何一段模板dna序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用pcR就可将模板dna在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则:
①引物长度:
15-30b,常用为20b左右。
②引物扩增跨度:
以200-500b为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基:
g+c含量以40-60%为宜,g+c太少扩增效果不佳,g+c过多易出现非特异条带。
atgc最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。
⑤引物3端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致pcR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性:
引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量:
每条引物的浓度01~1umol或10~100mol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度目前有两种tqdna聚合酶供应,一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
催化一典型的pcR反应约需酶量2。
5u(指总反应体积为100ul时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。
dntp的质量与浓度dntp的质量与浓度和pcR扩增效率有密切关系,dntp粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。
dntp溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1nh或1tris。
hcl的缓冲液将其ph调节到70~75,小量分装,-20℃冰冻保存。
多次冻融会使dntp降解。
在pcR反应中,dntp应为50~200umoll,尤其是注意4种dntp的浓度要相等(等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。
浓度过低又会降低pcR产物的产量。
dntp能与g2+结合,使游离的g2+浓度降低。
模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度,是pcR成败与否的关键环节之一,传统的dna纯化方法通常采用sds和蛋白酶k来消化处理标本。
sds的主要功能是:
溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,sds还能与蛋白质
结合而沉淀;
蛋白酶k能水解消化蛋白质,特别是与dna结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸。
提取的核酸即可作为模板用于pcR反应。
一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于pcR扩增。
Rna模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶k法,
要防止Rnse降解Rna。
g2+浓度g2+对pcR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的pcR反应中,各种dntp浓度为200umoll时,g2+浓度为15~20mmoll为宜。
g2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低tqdna聚合酶的活性,使反应产物减少。
pcR反应条件的选择
pcR反应条件为温度、时间和循环次数。
温度与时间的设置:
基于pcR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。
在标准反应中采用三温度点法,双链dna在90~95℃变性,再迅速冷却至40~60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70~75℃,在tqdna聚合酶的作用下,使引物链沿模板延
伸。
对于较短靶基因(长度为100~300b时)可采用二温度点法,除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸(此温度tqdna酶仍有较高的催化活性)。
①变性温度与时间:
变性温度低,解链不完全是导致pcR失败的最主要原因。
一般情况下,93℃~94℃lmi
n足以使模板dna变性,若低于93℃则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响。
此步若不能使靶基因模板或pcR产物完全变性,就会导致pcR失
败。
②退火(复性)温度与时间:
退火温度是影响pcR特异性的较重要因素。
变性后温度快速冷却至40℃~60℃,可使引物和模板发生结合。
由于模板dna比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。
退火温度与时间,取决于引物的长度
、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度。
对于20个核苷酸,g+c含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。
引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度:
tm值(解链温度)=4(g+c)+2(a+t)
复性温度=tm值-(5~10℃)
在tm值允许围内,选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合,提高pcR反应的特异性。
复性时间一般为30~60se,足以使引物与模板之间完全结合。
③延伸温度与时间:
tqdna聚合酶的生物学活性:
70~80℃150核苷酸s酶分子
70℃60核苷酸s酶分子
55℃24核苷酸s酶分子
高于90℃时,dna合成几乎不能进行。
pcR反应的延伸温度一般选择在70~75℃之间,常用温度为72℃,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
pcR延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般1kb以内的dna片段,延伸时间1min是足够的。
3~4kb的靶序列需3~4min;
扩增10kb需延伸至15min。
延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。
对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些。
循环次数循环次数决定pcR扩增程度。
pcR循环次数主要取决于模板dna的浓度。
一般的循环次数选在30~40次之间,循环次数越多,非特异性产物的量亦随之增多。
pcR技术概论
聚合酶链反应(polymersecinReion,pcR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。
它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点;
能在一个试管
内将所要研究的目的基因或某一dna片段于数小
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