以斑马鱼为模型的纳米壳聚糖安全性评价研究Word文件下载.docx
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Abstract:
Thisprojectacutedthetoxicityofchitosannanoparticlesbyzebrafishmodeltoevaluatethesafetyofnano-chitosaninvivo.Usingnormalchitosanasreference,measuringthevaluesofLC50at96hpfand120hpf,TC50at120hpf,hatchingrate,bodyweight,bodylengthandheartrateandotherindicatorsofzebrafishembryostoevaluatethesafetyofnano-chitosan.Fromtheresultswecaninferthatnano-chitosanissaferthanthenormal.Inordertostudytheneurologicaleffectsofchitosannanoparticlesononzebrafishlarvae,Iexaminedthebehaviorofzebrafishlarvae.Theresultofvitalitytestshowsthathighconcentrationofnano-paticlescancauseadaptabilitydeclineinzebrafish.
*
Keywords:
zebrafishmodels;
chitosannanoparticles;
safetyevaluation.
正文目录
1引言
壳聚糖(chitosan)是由甲壳素经脱乙酰基反应后所得到的多聚糖。
自然界中,壳聚糖广泛存在于接合菌的细胞壁、酵母和原生动物、小球藻、昆虫表皮,特别是存在于甲壳类动物的外骨骼中。
1811年,法国科学家HenriBraconnot在蘑菇中发现甲壳素。
1820年,从昆虫表皮提取出甲壳素。
1859年,Rouget报告称把壳聚糖在氢氧化钾溶液中煮沸可以得到壳聚糖。
1894年,Hoppe-Seyler将它命名为壳聚糖。
因为壳聚糖具有很多独特的理化和生物性质,所以上世纪90年代的欧美医学界和营养学界曾将其称之为“第六生命要素”[1],是一种来源丰富、无毒害、生物相容性好、可降解的天然高分子材料。
壳聚糖具有很多重要的生理功能,如抑制细菌活性[2]、抗肿瘤和抗癌[3]、降低人体胆固醇[4]、增强人体免疫力[5]、增加人体吸收钙和铁的速度[6]、消炎[7]和修复关节[8]等。
工程纳米材料的毒理学是一个较新的发展领域。
1990年美国召开了第一届纳米科技大会,这次会议标志着纳米科学的正式诞生。
从此纳米技术飞速发展,被应用于很多的领域,可以说它已经融入我们的日常生活,成为不可或缺的一部分,涉及化妆品[9]、食品、药物输送系统[10]、治疗[11]和生物传感器[12]等诸多领域。
但是关于其对环境和健康的影响的担忧仍然没有得到解决,它们在体内分布的情况和生物活性也鲜为人知。
纳米材料的安全性还有待实验来证明[13]。
据报道,相同浓度情况下,特细微粒运送过程中造成的危害比大颗粒更大[14]。
首先,纳米粒子粒径极小,能轻易地通过皮肤、呼吸道、消化道等进入人体,还能穿透细胞膜。
一般认为,同一物质的纳米级粒子和微米级粒子相比,前者引发炎症和肿瘤的可能性更大。
其次,纳米材料具有极高的表面活性,可能会放大对生物体的毒性效应。
对此,美国已有部分科学家开始研究评价纳米粒子安全性的课题[15]。
英国政府也要求关注纳米技术可能造成的伦理和社会问题[16]。
近年来,将壳聚糖制备成小分子纳米物质,挖掘壳聚糖纳米粒子的应用价值成为研究领域的一个新热点。
如Bugamelli等采用交联剂抗坏血酸棕榈酸酯,制备出胰岛素壳聚糖纳米粒子,实验结果显示这种纳米粒子可以有效地改善胰岛素在体内的释放过程,使其持续恒速释放达80h[17]。
Angela等制备出环胞素A壳聚糖纳米粒,实验结果显示这种纳米粒子可以有效地用于外眼球疾病治疗中,具有良好的靶向能力[18]。
Wang等[19]通过研究发现和普通饲料、含壳聚糖的饲料相比,在水产养殖饲料中添加纳米壳聚糖能促进罗非鱼的生长、提高肉质。
因此通过对壳聚糖纳米粒子的毒理学研究,对其在各行业的应用及可持续发展具有重大的意义。
高等生物基本是从单细胞受精卵发育而来,而且不同高等生物在胚胎发育早期非常相似。
鱼类早期胚胎毒理学研究对人类胚胎研究具有很大的借鉴意义。
斑马鱼成体个体小,可以进行高密度养殖,卵生且排卵量大,胚胎发育时间短,与人体基因相似度很高达87%[20],亲鱼体型小,可以获得大量样本减少误差,被认为是研究早期发育的最佳模式生物。
斑马鱼胚胎和幼鱼均完全或部分透明,具有光学透明性,可以在活体状态下观察分析器官组织变化[21],不需要进行病理切片,并且能通过渗透作用吸收小分子物质[22]。
表明斑马鱼是优良的人类疾病生物模型。
本研究将普通壳聚糖作为参照,来评价纳米壳聚糖对斑马鱼胚胎的生物安全性,主要涉及壳聚糖对斑马鱼胚胎的发育毒性和神经毒性的研究,旨在更深入地了解纳米壳聚糖对生物体的安全性,为纳米壳聚糖的安全应用提供依据。
2实验材料与方法
2.1实验动物
实验选取AB品系的斑马鱼作为受试动物,由OregonStateUniversity的分子毒理研究中心提供。
斑马鱼是一种性情温和的杂食性热带淡水鱼类,已经被很多科学家作为模式生物应用于分子遗传学和发育生物学研究。
斑马鱼的正常发育温度为25~31℃,最适生长繁殖温度为28.5℃,当生活环境温度低于11℃时会出现死亡。
2.2实验试剂
胚胎培养液(EM)、纳米壳聚糖溶液。
实验所用试剂均为分析纯。
(1)胚胎培养液(Embryomedium,EM)
斑马鱼对水质要求不高,养殖pH范围在7~8,实验室饲养一般用氧饱和度>80%、温度为28±
1℃曝气自来水即可。
本实验采用Hank’s液进行培养。
配制方法如表1。
表1胚胎培养液配制方法[23]
储备液成分1LEM中含量
1KCl=0.4g,NaCl=8.0g,加去离子水至100mL10mL
2KH2PO4=0.60g,Na2HPO4=0.35g,加去离子水至100mL1mL
3CaCl2=0.72g,加去离子水50mL10mL
4去离子水959mL
5MgSO4·
7H2O=1.23g,加入去离子水至50mL10mL
6NaHCO3=0.35g,加入去离子水至10mL(fresh)10mL
备注:
基础溶液1、2、3、5需要在4℃条件下保存,6现用现配,配制时基础溶液按编号顺序依次添加,然后调节pH=7.2,最后将溶液在4℃下保存备用。
(2)暴露液
配制方法如下:
壳聚糖溶液:
用分析天平称取40mg壳聚糖,将其溶解于100mL的1%冰醋酸中,配制成400mg/L储备液,使用时用EM稀释成所需浓度。
纳米壳聚糖:
取1%的醋酸溶液,加入壳聚糖溶解,形成0.5mg/mL的壳聚糖溶液,用1MNaOH调节pH为3.4;
溶液在温和转速的磁力搅拌下,滴入1mg/mL的STPP(工业三聚磷酸钠)溶液,壳聚糖和STPP质量比为2.5:
1,将混合溶液在室温下进行磁力搅拌,并持续60min,直到分散液出现淡蓝色乳光状态,形成壳聚糖纳米粒子。
纳米壳聚糖溶液:
将制备的纳米壳聚糖(粒径大约为87nm)配制成400mg/L母液,使用时用EM稀释成所需浓度。
2.3实验仪器
本实验所用仪器:
全封闭斑马鱼循环系统(购自美国AHAB公司);
光照恒温培养箱(RXZ-300C)(购自宁波江南仪器厂);
体式显微镜(NikonSMZ1500)(购自上海千欣仪器有限公司);
精密电子天平(SatoriusBS124S)(购自北京赛多利斯仪器系统有限公司);
超纯水器(UPWS-1-20T)(购自杭州永洁达净化科技有限公司);
旋涡混合器(VORTEX-6)(购自江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司);
电热恒温鼓风干燥箱(DGG-9140B)(购自上海华岩仪器设备有限公司);
斑马鱼幼鱼行为分析系统(Viewpoint)(购自法国);
96孔无菌细胞培养板(购自碧云天生物技术研究所);
24孔无菌细胞培养板(购自碧云天生物技术研究所)。
2.4实验方法
2.4.1亲鱼驯养
选取体形和行为正常、无鱼病、体长范围为4~6cm的斑马鱼作为实验用鱼[28],饲养在全封闭斑马鱼循环体系中。
2.4.1.1产前强化培育
光照周期为14L:
10D,采取自动控光。
水温28±
1℃,pH值为7~8。
为控制产卵时间和产卵量,在产卵前两周,将养殖系统中的雌、雄斑马鱼分开,单独饲养2~3天。
在早上和下午喂养活体丰年虫,中午喂养成鱼饲料,以5分钟内食完为止。
投喂次数过多会使鱼体发胖而影响性腺发育[27]。
2.4.1.2受精卵采集
斑马鱼受精方式是体外受精,繁殖周期一般是7天左右[27]。
采集胚胎前一晚给鱼适量多喂些食物,然后将亲鱼按雌雄1:
1配对,放入孵化器中关灯。
第二天早上开灯后一小时内采集卵粒。
受精卵采集时,注意除去混杂的污物和未正常受精的卵粒。
清洗后放入无菌胚胎培养液,立即置于光照培养箱中培养。
6hpf(hourspost-fertilization)后,在体视显微镜下挑选发育处于同一阶段的健康受精卵。
2.4.1.2胚胎孵化
孵化水温控制在25℃-28℃之间,pH值为6.5-7.5,在水中加入一定量的海盐,使电导率为450-1000µ
S/cm。
2.4.2纳米壳聚糖对斑马鱼胚胎的发育毒性试验
2.4.2.1染毒胚胎发育过程观测指标
不同发育时间段我们可以观察到的斑马鱼胚胎毒理学终点指标如表2所示。
表2在不同发育阶段斑马鱼胚胎可以被观察到的毒理学指标
发育时间(h)毒理学终点
4卵凝结;
囊胚发育
8外包活动阶段
12原肠胚终止体节开始形成;
胚孔关闭
16尾部脱离卵黄,体节数
24尾部延展;
20s内主动活动;
眼点发育
36心跳;
血液循环
48黑色素细胞发育;
心率;
耳石发育
72孵化率;
畸形率
查阅大量文献后,本实验选择以下毒理学终点作为胚胎发育毒性实验的观测指标,如表3所示。
表中“I类指标”是指“致死性指标”,“II类指标”是指“非致死性指标”。
表3按是否致死所划分斑马鱼胚胎的毒理学终点[24]
I类指标II类指标
卵凝结体节数显著减少
不开始原肠胚活动无血液循
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