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主要是从原核生物中分离纯化来的。
(2)限制性内切酶的作用:
能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序
列,并能将每一条链上特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开。
(3)限制性内切酶的切割方式及结果:
①在中心轴线两侧将DNA切开,切口是黏性末端。
②沿着中心轴线切开DNA,切口是平末端。
2.DNA连接酶——“分子缝合针”
(1)来源:
大肠杆菌、T4噬菌体
(2)DNA连接酶的种类:
E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。
(3)作用及作用部位:
E.coliDNA连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸二
酯键,T4DNA连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。
比较有关的DNA酶(详情见附件)
DNA聚合酶:
在DNA复制时起作用,将多个脱氧核苷酸催化聚合为脱氧核苷酸链(也就是
DNA单链),此时形成的化学键是磷酸二酯键。
DNA解旋酶:
在DNA复制或转录时起作用,将DNA的双链解开,作用对象是氢键,使氢
键断裂
DNA水解酶:
在消化道或细胞内起作用,将DNA水解为脱氧核苷酸,作用对象是磷酸二酯
键
DNA连接酶:
在DNA修饰过程或基因工程中起作用,将两个DNA片段连接起来,此时形
成的化学键是磷酸二酯键。
下图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化,图中依次表示限制性内切酶、DNA聚合酶、
DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是
3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
(1)分子运载车的种类
①质粒:
常存在于原核细胞和酵母菌中,是一种分子质量较小的环状的裸露的DNA分子,
独立于拟核之外。
②病毒:
常用的病毒有噬菌体、动植物病毒等。
(2)运载体作用:
①是用它做运载工具,将目的基因转运到宿主细胞中去。
②是利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
(3)作为运载体必须具备的条件:
①在宿主细胞中保存下来并大量复制
②有多个限制性内切酶切点
③有一定的标记基因,便于筛选。
4、教材拓展:
拓展点一限制酶所识别序列的特点
限制酶所识别的序列的特点是:
呈现碱基互补对称,无论是奇数个碱基还是偶数个碱基,都可以找到一条中心轴线,如图,中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。
如:
以中心线为轴,两侧碱基互补对称;
以
为轴,两侧碱基互补对称。
拓展点二DNA连接酶连接的是什么部位?
DNA连接酶是将一段DNA片段3′端的羟基与另一DNA片段5′端磷酸基团上的羟基连接起来形成酯键,而不是连接互补碱基之间的氢键。
第1节基因工程的基本操作程序
一、基因工程的基本操作步骤为四步曲:
1.目的基因的获取;
2.基因表达载体的构建;
3.将目的基因导入受体细胞;
4.目的基因的检测与鉴定。
(一).目的基因的获取
1.目的基因:
主要是指编码蛋白质的结构基因。
目前被较广泛提取使用的目的基因有:
苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等
2.目的基因的获取方法:
(1)基因文库:
将含有某种生物不同基因的许多DNA片断,导入到受体菌的群体中,各个受体菌分别含有这种生物的不同基因,
基因文库基因组文库:
含有一种生物的所有基因。
部分基因文库(如cDNA文库):
含部分基因,可由mRNA反转录而来。
(构建基因文库的目的:
为了在不知目的基因序列的情况下,便于获得所需的目的基因。
)
3.组成基因文库的目的基因获取途径
(1)利用PCR技术扩增目的基因
PCR:
是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。
原理:
DNA双链复制
原料:
模板DNA;
RNA引物;
四种脱氧核苷酸;
热稳定DNA聚合酶(Taq酶);
方法:
DNA受热变性解旋为单链、冷却后RNA引物与单链相应互补序列结合、DNA聚合酶作用下延伸合成互补链。
过程:
热变性(90-95)、退火(55-60)、延伸(70-75)。
特点:
指数形式扩增
二.基因表达载体的构建(基因工程的核心—体外进行)
1.目的:
使目的基因在受体细胞中稳定存在;
可以遗传给下一代;
使目的基因能够表达和发挥作用。
目的基因:
根据需要来选择。
2.基因表达启动子:
位于基因首端,RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动转录基因
载体的组成终止子:
位于基因尾端,使转录在所需要的地方停下来。
标记基因:
鉴别受体细胞中是否含有目的基因。
3.方法:
同种限制酶分别切割载体和目的基因,再用DNA连接酶把两者连接。
目的基因与运载体结合(以质粒为运载体)
4.条件:
同种限制酶、DNA连接酶、(目的基因、启动子、终止子、标记基因)
三.将目的基因导入受体细胞
转化:
目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
1导入植物细胞:
常用农杆菌转化法(将构建的载体导入农杆菌,再让农杆菌感染植物细胞),基因枪法、花粉管通道法。
(过程重点介绍)
②导入动物细胞:
显微注射法(将基因表达载体提纯,用显微仪注射到受精卵中)(过程重点介绍)
③导入微生物细胞:
Ca2+处理受体细胞成为感受态细胞,再进行混合。
提示:
农杆菌转化法的原理是利用农杆菌(胞内寄生菌)对植物的感染而把目的基因导入受体细胞。
四.目的基因的检测和鉴定
1、分子检测:
导入检测+表达检测
①导入检测:
利用DNA分子杂交技术,目的基因DNA一条链(作探针)与受体细胞中提取的DNA杂交,看是否有杂交带。
②表达检测:
目的为了检测是否转录出了mRNA,利用DNA-mRNA分子杂交技术,目的基因DNA一条链(作探针)与受体细胞中提取的mRNA杂交,看是否有杂交带。
③表达检测:
目的为了检测目的基因是否翻译成蛋白质。
抗体与蛋白质进行抗原-抗体杂交,看是否有杂交带。
2、个体水平的鉴定:
进行抗虫、抗病的接种实验,根据其性状判断是否表达。
①DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA,然后高温解成单链,再与同位素标记的DNA探针杂交;
②抗原-抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫,产生相应的抗体,并提取出而来的
第3节基因工程的应用
教材梳理
:
知识点一植物基因工程的应用
植物基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力(如抗除草剂、抗虫、抗病、抗干旱和抗盐碱等)以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面。
1.提高抗逆性
(1)常用抗虫基因:
用于抗虫(杀虫)的基因主要是Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等。
(2)常用抗病基因:
a.抗病毒基因有:
病毒外壳蛋白基因和病毒的复制酶基因;
b.抗真菌基因有:
几丁质酶基因和抗毒素合成基因
(3)其他抗逆基因:
环境条件对农作物的生产会造成很大影响,并且这些影响是多方面的,因此,抗逆性基因也有多种多样,如:
抗盐碱和干旱的调节细胞渗透压基因、抗冻基因、抗除草剂基因等等。
2.改良植物品质
由于人们的食品含有的营养不平衡,不能满足人们对食品的要求,这样,可以通过转基因技术,使植物能够合成某些本来不能合成的物质。
如科学家将必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因导入植物中,或者改变这些氨基酸合成途径中某种关键酶的活性,以提高氨基酸的含量。
知识点二动物基因工程的应用
1.用于提高动物生长速度:
由于外援生长激素基因的表达可以使转基因动物生长得更快,将这类基因导入动物体内,以提高动物的生长速率。
转基因绵羊和转基因鲤鱼。
2.用于改善畜产品的品质:
基因工程可用于改善畜产品的品质。
有些人对牛奶中的乳糖不能完全消化或食用后会出现过敏、腹泻、恶心等不适症状,科学家将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组,这样所获得的牛奶其成分不受影响,但乳糖的含量大大减低。
3.生产药物
基因工程不但促进了传统技术的变革,也为人类提供了传统产业难以得到的许多昂贵药品,并已形成基因工程制药业的雏形。
目前诸如人胰岛素、人生长激素、人脑激素、
α-干扰素、乙肝疫苗、蛋白C、组织血纤维蛋白溶酶原激活剂等数十种基因工程药物已实现商品化。
此外,还有促红细胞生成素、白细胞介素-2、肾素、心钠素等一大批珍贵药品正处于试用或临床试验阶段。
4.用转基因动物做器官移植的供体:
目前,人体移植器官短缺是一个世界性的难题,用其它动物的器官替代,又会出现免疫排斥现象,现在,科学家正试图利用基因工程方法对一些动物的器官进行改造,培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆器官。
知识点三基因治疗
1.概念:
基因治疗是把正常基因导入病人体内,使该基因的表达产物发挥功能,从而达到治疗疾病的目的,这是治疗遗传病的最有效的手段。
2.方法:
体外基因治疗和体内基因治疗
体外基因治疗:
先从病人体内获得某种相关细胞,进行培养,然后在体外完成基因转移,再筛选成功转移的细胞扩增培养,最后重新输入患者体内,这种方法叫做体外基因治疗。
体内基因治疗:
直接向人体组织细胞中转移基因的治疗方法叫做体内基因治疗。
说明:
对于遗传病的治疗最根本的方法是进行基因替换或修复。
基因治疗的最佳时期理论上是受精卵时期,这样可以使个体的每个细胞都含有正常基因,但在现实生活中是不可能的,因为不可能人人在受精卵时期进行基因检查。
其次是对患者进行相关细胞的基因替换,如:
对于遗传性糖尿病患者,只对胰腺的B细胞进行基因替换,该个体就能正常分泌胰岛素,糖尿病得以治疗;
但这种局部细胞的基因替换,并没有改变其它部位细胞的基因,如精原细胞,其后代很大可能还会患遗传性糖尿病。
教材拓展
拓展点一该节内容是对第2节知识的综合运用,是近几年及今后几年高考的主考点。
在学习这部分知识时,要注意以下几点:
1.熟练、灵活掌握第2节的基础知识,形成系统的、完善的知识体系
2.目的基因来自其他生物,目的基因和受体细胞的基因构成基因重组,这是基因工程的原理。
3.常考知识为基因操作的基本步骤
4.相关知识为DNA的结构和复制、基因控制蛋白质的合成及对性状的控制、基因突变、酶的性质和作用、其他生物工程等
5.解决的方法是学好相关知识,达到灵活运用程度,进行知识迁移。
拓展点二基因治疗的过程(以镰刀形细胞贫血症的治疗为例)
步骤
过程
获取正常的血红蛋白基因
用限制性核酸内切酶从人的DNA分子中切取血红蛋白基因
形成重组载体
用同一种限制性核酸内切酶在载体DNA上切开一个切口,用DNA连接酶将正常血红蛋白基因连接在载体DNA上,形成重组载体
重组载体的转化与筛选
将携带正常血红蛋白基因的重组载体导入患者的造血干细胞中,并将重组载体插入到染色体。
用选择培养基筛选出含重组质粒的造血干细胞。
将含正常血红蛋白基因的造血干细胞回输给患者骨髓
将携带正常血红蛋白基因的造血干细胞输入患者骨髓中,此造血干细胞产生含正常血红蛋白的红细胞,以根治镰刀形细胞贫血症
拓展点三利用微生物生产药物的优越性
所谓利用微生物生产蛋白质类药物,是指将人们需要的某种蛋白质的编码基因,构建成表达载体后导入微生物,然后利用微生物发
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