指南RNA提取和Northern blotWord文档格式.docx
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2.实验原理
RNA是一类极易降解的分子,要得到完整的RNA必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。
高浓度强变性剂硫氰酸胍,可以溶解蛋白质、破坏细胞结构,使核蛋白与核酸分离,失活RNAase,所以RNA从细胞中释放出来时不会被降解。
细胞裂解后,除了RNA,还有DNA、蛋白质和细胞碎片,通过苯酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。
硫氰酸胍—酚—氯仿法提出RNA:
硫氰酸胍与β-巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性;
硫氰酸胍使蛋白质变性,从而释放RNA。
甲醛与谷氨酸残基的单亚氨基基团形成不稳定的碱基配对,这些配对通过阻止链内碱基配对而是RNA维持在变性状态。
由于此种配对不稳定且容易被稀释除去,因此只有当甲醛存在于缓冲液或凝胶中时,RNA才能维持在变性状态。
变性消除了二级结构的单链RNA在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率与其大小的对数成正比。
有溴化乙锭存在时,电泳后28SrRNA和18SrRNA应当能清楚地在紫外灯下看到,有时能看到一条由tRNA和5SrRNA组成的、较模糊、迁移较快的带。
如果RNA没有被降解,28SrRNA的亮度应当是18SrRNA亮度的1.5-2.0倍,且这两条带都没有弥散现象。
mRNA是不可见的,除非过量上样。
3.实验设备
移液器,tip头,tip头盒、台式高速离心机,研钵,1.5ml离心管,三角瓶,磁力搅拌器,试剂瓶,
-80?
冰箱,水平凝胶电泳槽,稳压电泳仪,微波炉,50ml三角瓶4.实验试剂
RNA提取液:
0.8mol/L盐酸胍,0.4mol/L硫氢酸铵,0.1mol/L醋酸钠(pH5.0),5%甘油,38%Tris-饱和酚。
10×
MOPS缓冲液(吗啉代丙烷磺酸,2-(N-morpholino)propanesulfonicacid):
0.2mol/LMOPS,50mmol/L醋酸钠,10mmol/LEDTA。
RNA上样缓冲液:
62.5%去离子甲酰胺,16%10×
MOPS,22%甲醛。
电泳缓冲液:
用无菌水稀释10×
MOPS,使终浓度为1×
MOPS。
其他试剂:
琼脂糖,1mg/ml溴乙锭,溴酚蓝,甲醛,β-巯基乙醇,氯仿,异戊醇,75%乙醇,1.2MNaCl,异丙醇,灭菌的ddHO。
2
5.实验步骤
(1)于1.5mlEppendorf管中加入1mlRNA抽提液、30µ
lβ-巯基乙醇。
(2)用液氮预冷研钵及三角瓶、钥勺,将直根皮放入预冷研钵后,加入液氮,迅速冷冻后快速研磨至
粉末状。
(3)迅速用钥勺加粉末于抽提液中,剧烈震荡混匀10分钟。
(4)加入350µ
l氯仿/异戊醇,剧烈震荡混匀5分钟。
4?
、12000rpm离心15min。
(5)取上清液于一新管中,加入等体积的氯仿/异戊醇,剧烈震荡混匀10分钟。
、12000rpm离心10min。
(6)取上清液于一新管中,加入300µ
l1.2MNaCl、等体积异丙醇,混匀室温放置10min。
(7)4?
、12000rpm离心10min,弃上清,75%酒精洗沉淀,4?
、12000rpm离心5min。
弃上清,空气
干燥10-20min,加20µ
l无菌水溶解沉淀。
(8)用透明胶带将胶板的两端封好。
(9)电泳胶的制备
试剂用量
琼脂糖(0.8%)0.16g
MOPS4.8ml
水15.2ml
(10)倒胶:
在距底板0.5-1.0mm的位置上放置梳子,将温热的琼脂糖凝胶倒入胶模中(注意不要出现
气泡),凝胶厚度在3-5mm之间。
(11)RNA样品变性:
在1.5ml灭菌离心管中加入3.2,l上样缓冲液,1.3,lRNA样品,混合震荡,使之充
分混匀,手掌离心机离心10s。
65?
金属浴5min,冰上冷却后,手掌离心机离心10s。
(12)在凝胶完全凝固后(室温下30-40min),撕去透明胶,小心地将玻璃板移至装有1×
MOPS的电泳
槽中,轻轻地拔去梳子,且使缓冲液没过胶面约1mm。
电泳槽中的缓冲液最好与制胶所用的缓冲
液是同一批次的,若两种缓冲液中的离子强度及pH不一致,将影响核酸的迁移率。
(13)点样:
将冷却的变性RNA样品与1,l溴酚蓝混合后,用微量取样器慢慢将混合物加入上样孔中。
(14)盖上电泳槽并通电,使RNA向阳极(红线)移动。
采用65V电压进行电泳。
小电泳槽V=50-65v;
中电泳槽V=100v;
大电泳槽V=150v。
(15)当溴酚蓝在凝胶中移出适当距离后(约半小时),切断电流,取出玻璃板,在紫外灯下观查凝胶。
6.作业
(1)按要求认真撰写报告,包括实验目的、实验原理、实验材料、实验用品及药品、实验步骤。
(2)如何避免或减少RNA的降解,
7.RNA制备中的关键因素
RNA酶的特点:
(1)存在广泛:
尘土、实验器皿、试剂、汗液及唾液当中均有RNA酶(RNase)存在。
(2)活性稳定:
耐热、耐酸碱,用水煮沸都不能使其失活,蛋白质变性剂可使之暂时失活,一旦去除变性剂后RNase会恢复其活性。
(3)其发挥活性不需辅助因子:
二价离子整合剂不能抑制其活性。
创造无RNase的环境:
(1)避免手、唾液的污染:
戴口罩、手套,并经常更换(使用一次性手套)。
(2)空气中的细菌等微生物:
在超净台中操作,工作区域应与进行普通微生物实验的区域分隔开来,特别是那些用于细菌接种、培养基和试剂配制的区域,这些区域富含RNA酶。
(3)玻璃器皿的处理:
用水清洗干净后,200?
干烤4小时。
(4)塑料用品的处理:
尽量使用一次性塑料制品,并高压灭菌。
(5)RNA电泳槽的处理:
需用去污剂洗涤,用水冲洗,乙醇干燥,再浸泡于HO溶液中10分钟后,22
用0.1,DEPC处理过的水彻底冲洗。
(6)降低RNase活性:
尽量在冰浴中操作。
去除内源RNase的污染:
(1)在细胞破碎的同时,RNase也被释放出来,原则上应尽可能早地去除细胞内蛋白并加入RNase抑制剂。
(2)去除蛋白质的试剂:
由于RNase为一种蛋白质,故去除蛋白质的试剂可非特异地抑制RNase的活性。
如酚、氯仿,其作用是使蛋白质与核酸解离,同时作为蛋白质变性剂,可以抑制RNase的活性;
并且酚与氯仿联合使用可增强对RNase的抑制;
蛋白酶K,与1%~2%的SDS合用其效果更佳;
阴离子去污剂,常用的有SDS、十二烷基肌氨酸钠等,可以解聚核酸与蛋白质的结合,并且与蛋白质带正电荷的侧链结合,在高盐存在下形成SDS-蛋白质复合物而沉淀。
(3)解偶剂(胍类):
盐酸胍、异硫氰酸胍。
目前认为,异硫氰酸胍是一种RNase最有效的抑制剂。
制备RNA时,如果缓冲液中含有异硫氰酸胍,则可在破碎细胞的同时也使RNase失活。
异硫氰酸胍有破坏细胞结构、使核酸从核蛋白中解离出来,并对RNase有强烈的变性作用。
异硫氰酸胍与β-巯基乙醇(破坏蛋白质的二硫键)合用,使RNase被极度抑制。
(4)低特异性的RNase抑制剂:
DEPC:
是很强的核酸酶抑制剂,与蛋白质中的组氨酸的咪唑环结合,使蛋白质变性。
因此,凡是不能用高温烘烤的材料皆可用DEPC处理(0.1,溶液浸泡过夜*,然后再用蒸馏水冲净。
试剂亦可用DEPC处理,再煮沸l5分钟或高压以除去残存的DEPC。
否则,如不除尽DEPC,它能使嘌呤羟甲基化从而破坏mRNA的活性。
另外,注意配制含有Tris的试剂不能用DEPC处理,因为DEFC在Tris中迅速分解。
注意:
DEPC可能是致癌物,应小心操作。
(5)RNase特异抑制剂:
RNase阻抑蛋白质(RNasin):
它与RNA酶紧密结合,使其失活。
与lmmol,Lβ-巯基乙醇合用,能发挥最大抑制作用。
但不应使用已多次冻融或在氧化条件下保存的抑制剂,因为这会使蛋白质变性,使被结合的RNA酶释放出来。
贮存:
存放于50,的甘油或5mmol,Lβ-巯基乙醇中,-20?
保存。
反复冻融,RNasin极易被破坏。
8.实验结果:
二、Northern杂交
在转录水平上研究和了解基因的表达与调控是基因工程操作的重要内容。
Northern杂交可以测定总
+RNA或poly(A)RNA中特定mRNA分子的大小和表达丰度,RNA分子在变性琼脂糖凝胶中电泳,按其分子的大小分开,然后将RNA转至尼龙膜或硝酸纤维素膜上,经过自外交联固定,用探针与之杂交,经显影后可以得到待测基因RNA表达水平的情况。
利用Northern杂交可以检测不同生长发育阶段和不同的组织部位相关基因的表达情况。
通过本实验学习Northern杂交基本原理,学习掌握Northern杂交的基本实验步骤和检测方法.
要证明外源基因在植物染色体上整合的最可靠的方法是分子杂交,只有经分子杂交鉴定过的植物才可以称为转基因植物。
同时也可以利用Northern杂交来检测不同生长发育阶段和不同的组织部位相关基因的表达情况。
分子杂交鉴定包括两大部分内容,一是核酸分子杂交,其中又包括Southern杂交及Northern杂交。
二是属于蛋白质分子“杂交”的Western杂交。
核酸分子杂交是指非同一分子来源但具有互补序列(或某一区段互补)的两条多核苷酸链,通过Watson—Crick碱基配对形成稳定的双链分子的过程。
若其中的一条链被人为标记上,该标记可以通过某种特定方法检出,即成为所谓的探针。
探针与其互补的核苷酸序列杂交后,杂交体也就带上了同样标记,可被检测出来。
这样,以特定的已知核酸序列做探针,就可以在诸多的核苷酸序列中,通过杂交探测出与其互补的序列,因而分子杂交是进行核酸序列分析,重组子鉴定,及检测外源基因整合及表达的强有力的手段。
它具有灵敏性高、特异性强(可鉴别出20个碱基对左右的同源序列)的特点,是当前鉴定外源基因整合及表达的权威方法。
分子杂交可以在液相及固相中进行。
目前实验室中广泛采用的是在固相膜上进行的固一液杂交。
根据杂交时所用的具体方法,核酸分子杂交又可分为印迹杂交、斑点(dot)杂交、狭槽(slot)杂交和细胞原位(insitu)杂交等。
印迹杂交是一种将核酸凝胶电泳、印迹技术、分子杂交融为一体的方法。
被检的RNA分子经琼脂糖凝胶电泳分离后原位转移到固相膜上,杂交液中的探针与印迹到固相膜上的特异片段发生杂交。
分子杂交的实验涉及三大内容,即制备杂交探针;
制备被检的核酸或蛋白质样品(或标本);
印迹及杂交。
Northern杂交是以DNA或RNA为探针,检测RNA链,用于外源基因转录产物特异mRNA的检测。
整
合到植物染色体上的外源基因如果能正常表达,在转化植株
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