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1932年德国人E.Ruska和M.Knoll发明透射电镜,Cytology发展为CellBiology。
5.分子细胞生物学时代:
1953年,JD.Watson和FHC.Crick提出DNA双螺旋模型。
与Wilkins分享1962年诺贝尔生理学与医学奖。
1958年Crick提出分子遗传的“中心法则”。
1961-1964年Nirenberg等破译遗传密码。
国家科技图书文献中心(NSTL)EBSCOhost外文全文数据库Springer外文电子期刊
第二章细胞生物学实验技术
光学显微镜:
以可见光(或紫外线)为光源。
电子显微镜:
以电子束为光源。
1.光学显微镜:
(1)普通光学显微镜:
构成:
①照明系统②光学放大系统③机械装置
(2)荧光显微镜(3)激光共聚焦扫描显微境LCSM(4)暗视野显微镜(5)相差显微镜(6)偏光显微镜(7)微分干涉差显微镜(DIC)(8)倒置显微镜
2.电子显微镜
(1)透射电子显微镜TEM
(2)扫描电子显微镜(3)扫描隧道显微镜
1)超薄切片:
用于电镜观察的标本须制成厚度仅50nm的超薄切片,用超薄切片机制作。
通常以锇酸和戊二醛固定样品,丙酮逐级脱水,环氧树脂包埋,以热膨胀或螺旋推进的方式切片,重金属(铀、铅)盐染色。
2)负染技术:
用重金属盐(如磷钨酸)染色;
吸去染料干燥后,样品凹陷处铺了一层重金属盐,而凸的出地方没有染料沉积,从而出现负染效果,分辨力可达1.5nm左右。
3)冰冻蚀刻freeze-etching:
亦称冰冻断裂。
标本置于干冰或液氮中冰冻。
然后断开,升温后,冰升华,暴露断面结构。
向断面喷涂一层蒸汽碳和铂。
然后将组织溶掉,把碳和铂的膜剥下来,此膜即为复膜(replica)
断面的三种处理方法:
蚀刻、不蚀刻、深度蚀刻
3.显微操作技术:
是在倒置显微镜下利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。
包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。
第三章细胞培养与细胞杂交
1.细胞培养技术(cell
culture)是指细胞的体外培养。
即在无菌条件下,把动物和植物的细胞从有机体分离出来,在模拟体内的环境中,给以营养物质,使细胞不断生长,繁殖或传代,借以观察细胞生长,分裂以及细胞衰老,死亡等生命现象。
2.细胞株(cell
strain):
从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群,能够繁殖50代左右,在培养过程中其特征始终保持。
3.细胞系(cell
line):
从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞,在培养条件下可无限繁殖
4.克隆(clone):
亦称无性繁殖系或简称无性系。
对细胞来说,克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。
5.动物细胞培养:
细胞培养方式大致可分为两种:
群体培养(mass
culture)、克隆培养(clonal
culture)
群体培养:
将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中,让细胞贴壁生长,汇合后形成均匀的单细胞层。
6.细胞融合:
通过培养和诱导,两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融(cell
fusion)或细胞杂交(cell
hybridization)。
7.基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体(homokaryon);
来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体(heterokaryon)。
8.同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并,称自发融合;
异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合,称诱发融合。
9.诱导细胞融合的方法:
生物方法(病毒)、化学方法(聚乙二醇PEG)、物理方法(电激和激光)。
某些病毒如:
仙台病毒、副流感病毒和新城疫鸡瘟病毒的被膜中有融合蛋白(fusion
protein),可介导病毒同宿主细胞融合,也可介导细胞与细胞的融合,因此可以用紫外线灭活的此类病毒诱导细胞融合。
化学和物理方法可造成膜脂分子排列的改变,去掉作用因素之后,质膜恢复原有的有序结构,在恢复过程中便可诱导相接触的细胞发生融合。
第四章生物化学与分子生物学技术
1.细胞化学技术:
组织化学或细胞化学染色(histochemical
or
cytochemical
staining)是利用染色剂可同细胞的某种成分发生反应而着色的原理,对某种成分进行定性或定位研究的技术。
利用这种方法对细胞的各种成分几乎都能显示,包括有无机物、醛、蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶等。
2.固定①物理固定:
血膜空气快速干燥、冷冻干燥。
②化学固定。
3.显示方法:
①金属沉淀法②Schiff反应③联苯胺反应④脂溶染色⑤法茚三酮反应
4.免疫细胞化学(immunocytochemistry)是根据免疫学原理,利用抗体同特定抗原专一结合,对抗原进行定位测定的技术。
抗原主要为大分子或与大分子相结合的小分子;
抗体则是由浆细胞针对特定的抗原分泌的γ球蛋白。
如果将抗体结合上标记物,再与组织中的抗原发生反应,即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。
常用的标记物有荧光素和酶:
免疫荧光法、酶标免疫法。
5.显微光谱分析技术:
细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱,核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线。
有的成分经组织化学染色后,对可见光有特定的吸收光谱。
根据细胞成分所具有的这种特性,可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定性,甚至定量测定。
6.放射自显影术:
用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。
原理:
将放射性同位素标记的化合物导入生物体内,经过一段时间后,制取切片,涂上卤化银乳胶,经放射性曝光,使乳胶感光。
这种技术与电镜样品处理,则为电镜放射自显影。
7.杂交技术:
具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段,在适当条件下,通过氢键结合,形成DNA-DNA,DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。
这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。
(1)原位杂交(insituhybridization):
用于检测染色体上的特殊DNA序列。
最初是使用放射性DNA探针,后来又发明了免疫探针法。
(2)Nouthern杂交:
是体外分析特异DNA序列的方法,操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段,经凝胶电泳分离后,转移到醋酸纤维薄膜上,再用探针杂交,通过放射自显影,即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列将RNA转移到薄膜上,用探针杂交,则称为Northern杂交。
8.PCR技术PCR即:
polymerasechainreaction。
反应体系:
①样品DNA;
②引物(primer),约15-20个核苷酸;
③4种dNTP;
④TagDNA聚合酶,最适作用温度75~80℃,短时间在95℃下不失活。
⑤缓冲体系和Mg2+。
反应过程:
①变性:
94℃;
②退火45~65℃;
③延伸:
72℃;
④重复“变性——退火——延伸”过程20-30次循环。
9.离心技术是分离细胞器及各种大分子基本手段。
转速为10~25kr/min的离心机称为高速离心机。
转速>
25kr/min,离心力>
89Kg者称为超速离心机。
超速离心机的最高转速可达100000r/min,离心力超过500Kg。
(1)差速离心Differentialcentrifugation特点:
介质密度均一;
速度由低向高,逐级离心。
用途:
分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。
沉降顺序:
核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高基体——核蛋白体。
可将细胞器初步分离,常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。
(2)密度梯度离心:
用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度,将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部,通过离心力场的作用使细胞和细胞成分分层、分离。
类型:
速度沉降、等密度沉降。
常用介质:
氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。
分离活细胞的介质要求:
1)能产生密度梯度,且密度高时,粘度不高;
2)PH中性或易调为中性;
3)浓度大时渗透压不大;
4)对细胞无毒。
10.流式细胞术:
对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术包被细胞的液流称为鞘液,所用仪器称为流式细胞计
11.细胞电泳:
在一定PH值下细胞表面带有净的正或负电荷,能在外加电场的作用下发生泳动。
各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞荷电量有所不同,故在一定的电场中的泳动速度不同。
检测细胞生理状态、分离不同种类的细胞。
第五章细胞(质)膜及表面结构
1.质膜(plasmamembrane)包在细胞外面所以又称细胞膜。
围绕各种细胞器的膜,称为细胞内膜。
①质膜和内膜在起源、结构和化学组成的等方面具有相似性,故总称为生物膜(biomembrane)。
②生物膜是细胞进行生命活动的重要物质基础。
质膜表面寡糖链形成细胞外被(cellcoat)或糖萼(glycocalyx)。
③质膜下的表层溶胶中具有细胞骨架成分组成的网络结构,除对质膜有支持作用外,还与维持质膜的功能有关,所以这部分细胞骨架又称为膜骨架。
④细胞外被、质膜和表层胞质溶胶构成细胞表面。
2.膜脂主要包括磷脂、糖脂和胆固醇三种类型:
(1)磷脂
(2)鞘磷脂(sphingomyelin,SM)在脑和神经细胞膜中特别丰富。
原核细胞、植物中没有鞘磷脂。
(3)糖脂:
最简单的糖脂是半乳糖脑苷脂,在髓鞘的多层膜中含量丰富;
变化最多、最复杂的糖脂是神经节苷脂(p43),神经节苷脂是神经元质膜中具有特征性的成分。
(4)胆固醇:
主要存在真核细胞膜上,其功能是提高双脂层的力学稳定性,调节双脂层流动性,降低水溶性物质的通透性。
(5)脂质体(liposome):
是一种人工膜。
人工脂质体可用于:
转基因制备的药物研究生物膜的特性
3.膜蛋白:
是膜功能的主要体现者。
根据膜蛋白与脂分子的结合方式,可分为:
整合蛋白(integralprotein)/膜内在蛋白,外周蛋白(peripheralprotein),脂锚定蛋白(lipid-anchoredprotein)
脂锚定蛋白可以分为两类:
糖磷脂酰肌醇连接的蛋白;
另一类脂锚定蛋白与插入质膜内小叶的长碳氢链结合。
4.质膜的流动镶嵌模型根据Fluid-mosaicmodel:
细胞膜由流动的双脂层和嵌在其中的蛋白质组成。
磷脂分子以疏水性尾部相对,极性头部朝向水相组成生物膜骨架;
蛋白质或嵌在双脂层表面,或嵌在其内部,或横跨整个双脂层,表现出分布的不对称性。
5.质膜的流动性:
由膜脂和蛋白质的分子运动两个方面组成。
(1)膜脂分子的运动:
①侧向扩散运动:
同一平面上相邻的脂分子交换位置。
②旋转运动:
围绕与膜平面垂直的轴进行快速旋转。
③摆动运动:
围绕与膜平面垂直的轴进行左右
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