酵母双杂交操作手册 by shenaoWord文档格式.docx
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DOSupplement;
Peptone,
withDMF)TEbufferDMSOPEG/LiAc(10X)TE/LiAcbuffer(10X)X-a-gal(
YeastPhenotypes
–––Ade,His,Leu,Requiresadenine(Ade),histidine(His),leucine(Leu),ortryptophan(Trp)inthe
–orTrpmediumtogrow;
isauxotrophicforatleastoneofthesespecificnutrients.
ExpressestheADE2reportergene;
i.e.,doesnotrequireAdeinthemediumto+Adegrow.
+HisExpressestheHIS3reportergene;
i.e.,doesnotrequireHisinthemediumtogrow.
+LacZExpressesthelacZreportergene;
i.e.,ispositiveforb-galactosidaseactivity.
+Mel1ExpressestheMEL1reportergene;
i.e.,ispositivefora-galactosidaseactivity.Miscellaneous
Ade2pProteinencodedbytheyeastADE2gene.
3-AT3-amino-1,2,4-triazole;
acompetitiveinhibitoroftheHis3protein.
CHXCycloheximide
Dropout(supplementorsolution);
amixtureofspecificaminoacidsandnucleosides
DOusedtosupplementSDbasetomakeSDmedium;
DOsolutionsaremissingoneor
moreofthenutrientsrequiredbyuntransformedyeasttogrowonSDmedium.
His3pProteinencodedbytheyeastHIS3gene.
MinimalSyntheticDropoutmedium;
comprisedofanitrogenbase,acarbonsourceSDmedium(glucoseorgalactose),andaDOsupplement.
YPHYeastProtocolsHandbook
SD/–AdeSD/–MetSD/–HisSD/–UraYPDAYPD/CHXSD/–LeuSD/–TrpStrain
PJ69-4A–+–++–––
–––++–––PJ69-4α
1
AH109–+–++–––
–––++–––Y187
YeastselectionBacterialselectionFusionEpitope
Cloningvectors
pGBKT7DNA/baitc-MycTRP1kanamycin
pGADT7AD/libraryHALEU2ampicillinControlvectors
pCL1GAL4LEU2ampicillin
pGADT7-TAD/T-antigenHALEU2ampicillinpGBKT7-53DNA-BD/p53c-MycTRP1kanamycinpGBKT7-LamDNA-BD/laminCc-MycTRP1kanamycin
.
缩写:
Ade腺嘌呤(adenine)His组氨酸(histidine)Leu亮氨酸(leucine)Trp色氨酸(tryptophan)
培养基成分及配制方法:
YPD&
SDBasefromCLONTECHalreadycontainsacarbonsource(Dextrose(glucose))
YPD:
20g/LPeptone,10g/LYeastextract,2%Dextrose(20g/L),20g/LAgar(forplatesonly)加入上述药品,加水至1L,调节PH值到6.5。
121:
C15分钟。
或者Dextrose溶液单独108:
C15分钟,YP配成溶液121:
C20分钟。
用前混合。
YPDA:
YPD+adenine
1LYPD培养基中加15mL过滤除菌的0.2%adeninehemisulfate,终浓度0.003%。
(Adeninehemisulfate其实可以耐高温,可以混在YPD中灭菌;
或者先灭YP,再加D和A。
)
SD:
6.7gYeastnitrogenbasewithoutaminoacids,2%dextrose(glucose),20gAgar(forplates
only),850mlH2O,100mloftheappropriatesterile10XDropoutSolution
•AdjustthepHto5.8ifnecessary,andautoclave.Allowmediumtocoolto~55:
Cbeforeadding3-AT,cycloheximide,additionaladenine,orX-gal.
•IfyouwishtoaddexcessadeninetoSDmedium,add15mlof0.2%adeninehemisulfatesolutionperliterofmedium.
(若用clontech公司的粉剂,SDbase加上相应的DOsupplement,121:
C15分钟)
•10XDropout(DO)Solution
多数的常用DO可从CLONTECH公司买到。
或者可以结合下面营养成分列表中标明的浓度,自己配制10XDO溶液。
10XDO溶液中含有除一种或少数几种之外的其他所有下面列举的营养成分。
注意,serine(丝氨
2
酸),asparticacid(天冬氨酸)和glutamicacid(谷氨酸)不被包括在下面的列表中。
因为它们将使培养基过酸,而且酵母可以内源性合成这几种氨基酸。
10XDO溶液可被高压灭菌,4:
C保存一年以上。
Example:
Tomakeoneliterof10X–Leu/–TrpDOSolution,combinethefollowing:
•200mgadeninehemisulfate腺嘌呤
•200mgarginineHCl精氨酸
•200mghistidineHClmonohydrate组氨酸
•300mgisoleucine异亮氨酸
•300mglysineHCl赖氨酸
•200mgmethionine甲硫氨酸
•500mgphenylalanine苯丙氨酸
•2000mgthreonine苏氨酸
•300mgtyrosine酪氨酸
•200mguracil尿嘧啶
•1500mgvaline缬氨酸
1LDissolvecomponentsin1LdeionizedH2O.Autoclave.
X-gal:
5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷。
(X-β-gal)
X-a-gal:
用DMF溶解X-a-gal,浓度为20mg/ml。
-20?
避光保存。
对于平板,1L缺陷培养基中冷却至55?
后加入1mlX-a-gal(20mg/ml)再倒平板。
或者每块冷却后的10cm/15cm平板上涂100ul/200ulX-a-gal(2mg/ml)。
注意:
若想要快速(1,24小时)确定某个酵母株是否含有MEL1,在平板上以上述体积涂20mg/ml的X-a-gal。
酵母菌株的保藏和培养:
酵母菌株可以于含25%甘油的YPD培养基中保藏在-70?
,若温度始终保持在-55?
以下,至少可以保藏1年以上。
转化后的酵母菌最好保藏在对应的SD培养基内,以始终保持选择压力。
酵母甘油菌种的制备:
a.无菌操作,从平板上刮下一个酵母单克隆。
b.1.5ml无菌EP管中,用200–500,lYPD培养基或适宜的SD培养基重悬菌落。
剧烈震荡,完全分散细胞。
加入50%的甘油等体积,使甘油终浓度为25%。
c.盖紧盖子,再次混匀EP管。
-70?
包藏。
酵母甘油菌的复苏:
a.少量冻存的甘油菌在YPD或适宜的SD平板上划线。
b.30:
C培养3,5天,直到菌落直径为2mm以上。
将这些作为“工作菌”平板。
c.将平板用封口膜封好,4:
C可保藏2个月以上。
每过1,2个月重新从冻存的甘油菌中划平板。
d.甘油菌可被反复冻融有限的几次而不影响细胞。
如果没有活化出来,或许是细胞沉淀在EP管底部。
这时候可以将EP管置于冰上解冻后,剧烈震荡,再重新划线。
过夜液体培养酵母菌:
a.从“工作菌”平板上取新鲜的(<
2-months)克隆用于实验。
每5ml培养基接种一个较大的克隆(直
3
径2–3-mm);
若菌落较小或者使用了更多的培养基,可以取多个克隆。
充分地剧烈振荡培养基1min以上,以彻底分散酵母细胞。
C培养16,18小时,230–270rpm。
对于大多数的菌株,培养物将达到生长的平台期(OD600>
1.5)。
不同的酵母株系的生长速率不同。
同时在一些转化子中,生长速率还会受到融合蛋白的影响。
另外,大多数株系在SD培养基中的加倍时间要比在YPD中长两倍左右。
c.如果需要对数生长期的培养物,转移足够的过夜培养物到新鲜的培养基中,使OD600=0.2–0.3。
30:
C培养3,5小时,230–250rpm。
对于大多数的菌株,OD600将为0.4,0.6。
注意:
在这个活化步骤
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