原核表达及纯化总结教学提纲Word文档格式.docx
- 文档编号:13452020
- 上传时间:2022-10-10
- 格式:DOCX
- 页数:8
- 大小:20KB
原核表达及纯化总结教学提纲Word文档格式.docx
《原核表达及纯化总结教学提纲Word文档格式.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《原核表达及纯化总结教学提纲Word文档格式.docx(8页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
反应体系如下:
模板
1µ
L
10×
PCR反应缓冲液(含Mg2+)
2µ
dNTP(2.5mmol/L/each)
1.6µ
上游引物(10µ
mol/L)
下游引物(10µ
Taq酶(5U/µ
L)
0.3µ
ddH2O
13.1µ
Total
20µ
条件:
94℃预变性10min
94℃变性45s
50℃退火45s
72℃延伸1min,30个循环的扩增反应
72℃延伸10min
4℃∞
1%琼脂糖凝胶电泳检测:
电泳上样时:
MarkerDL2000上样3µ
L
样品(1µ
Lloadingbuffer+6µ
LPCR产物混匀上样)
100V,20min;
紫外透射仪检测,出现目的带的对应菌落为阳性克隆。
(注意:
记得保存菌种)
3阳性克隆质粒抽提
取阳性克隆菌液200µ
L,加3ml含Amp+LB液体培养基,37℃200rpm/min培养3-4h,待菌液浑浊后,进行质粒抽提。
质粒抽提方法如下:
取1.5mL菌液于1.5mL离心管中
12000rpm离心30s,弃上清
加800μLSTE悬浮沉淀
重复STE漂洗沉淀的过程
加入100μL预冷的solutionⅠ,强烈振荡混匀
温和加入200μLsolutionⅡ(solutionⅡ现用现配),盖紧管口快速颠倒5次,
放置冰上2min至溶液清亮而粘稠
极温和加入150μL预冷的solutionⅢ,
倒置温和振荡10s,冰上放置5min
12000rpm离心5min
取上清(400μL),加入等量的酚/氯仿/异戊醇(25:
24:
1),振荡混匀
取上清(350μL),加入1/10体积(35μL)的NaAc(3M)
和2倍体积预冷的无水乙醇(700μL)上下颠倒5次,(无水乙醇在-20℃保存)
室温放置20min(-20℃沉淀效果更好)
13000rpm离心10min↓
弃上清(小心倒出),用1ml70%的乙醇贴壁冲洗漂洗沉淀
13000rpm离心10min
室温放置让乙醇挥发干净
用20μlTE溶解质粒DNA,每20μL体系中加入1μL1mg/mL的Rnase,37℃
作用30min,1%琼脂糖电泳定量检测纯度
所用试剂:
1、STE:
0.1mol/LNaCL
10mmol/LTris-HCL(pH8.0)
1mmolol/LEDTA
2、solutionⅠ:
50mmolol/LGlucose
25mmolol/LTris-HCL(pH8.0)
10mmolol/LEDTA(pH8.0)
3、solutionⅡ:
0.2mol/LNaOH
1%SDS
4、solutionⅢ:
5mol/LKAc60mL
冰醋酸11.5mL
无菌水28.5mL
(最终K+的浓度为3mol/L,Ac-的浓度为5mol/L)
4BL21的转化及诱导表达
质粒转化BL21感受态细胞方法如下:
取100µ
LBL21感受态细胞,加入1µ
L质粒
加入900µ
L无Amp+的LB液体培养基,37℃100rpm/min振荡培养1h
取100μL菌液全部涂LB平板(含Amp+)水平放置30min待菌液完全吸收后,
5目的蛋白的诱导表达
挑取单克隆菌落于3ml的LB液体培养基(含Amp+)中180rpm/min,37℃培养。
待菌液浓度OD600≈0.6时开始诱导:
1.首先取出50µ
L菌液留样
2.1:
1000向剩余菌液中加0.8M的IPTG3µ
3.30℃180rpm/min诱导4h收菌
6目的蛋白SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定
1.取700μL菌液13000rpm离心1min,弃上清
2.空菌对照及marker
3.加30μLPBS和30μL2×
SDS上样缓冲液,用枪吹匀
4.沸水煮10min,稍离心,将液体汇聚管底,取10µ
L上样
12%的胶浓缩胶90V10min
分离胶160V50min
考马斯亮蓝染色30min
脱色液脱色
二大量诱导表达
1.取300μL菌液,加入到50mLLB液体培养基(含Amp+)中180rpm/min37℃过夜
2.将50ml菌液全部加入到500mlLB液体培养基(含Amp+)中200rpm/min,37℃,
大约2h左右,此时OD600约等于0.6开始诱导
3.1:
1000向剩余菌液中加0.8M的IPTG550μL
诱导条件:
30℃180rpm/min
诱导时间:
4h收菌
(取700μL留样电泳分析,是否表达出来及表达位置和表达量)
三细胞裂解
1.将550ml菌液,收菌前准确称出瓶中(为计算湿菌重量)
2.分三次,4800rpm/min离心20min,在用PBS洗涤一次,倒置用滤纸控干
3.称全重,计算出湿菌重量
4.每克湿菌加5mlLysisbuffer(Tris:
50mMNacl:
300mMPH:
8.0)
混匀转移到50ml管内
5.每毫升菌液加1:
500加0.1MPMSF
6.加入终浓度为1mg/ml的溶菌酶E,玻棒搅动20min
7.-80℃反复冻融3-5次(冰水混合物中融化)
8.每克湿菌加4mg脱氧胆酸(脱氧胆酸先用1mlLysisbuffer溶解),取样30μL准备电泳分析
(玻璃棒37℃水浴中搅拌30min,此步骤若是不可溶性蛋白可这样处理,若是可容性蛋白可在冰水混合物中搅拌)
9.用注射器在冰水混合物中反复吹吸,使菌液不再成团,变得更加粘稠
10.超声20min(每次超声不得超过30s)
11.加终浓度5μg/ml的DNaseⅠ和RNaseA及终浓度10mM的CaCl2和MgCl2
12.室温摇床作用30min,注射器反复吹吸
13.补加一倍体积的LysisBuffer,同时加终浓度为1%的曲拉通。
(平时常温曲拉通储存液浓度为20%,否则不宜溶解)
14.反复吹吸
15.13000rpm/min20min
16.上清补加PMSF(1:
500)沉淀用bufferB溶解同样补加PMSF(1:
500)
BufferB:
NaH2PO420mMNacl500mMUrea8MPH:
8.0
BufferC:
6.8(不含咪唑,咪唑现用现加,终浓度10mM)咪唑2M(2M咪唑分装-20℃保存)
BufferD:
8.0(咪唑终浓度100mM)
分析:
上清及沉淀还有样品处理前的留样,进行电泳分析鉴定目的蛋白是可溶的还是不可溶的以便选择纯化方式
四His标签蛋白纯化(可溶和不可溶性)
可溶性蛋白纯化(上样前要将上清过0.22μm的滤膜)
1)washbuffer平衡柱子(不含咪唑)流速1ml/min
washbuffer:
NaH2PO450mMNacl300mMPH:
6.8过滤0.22μm除气
2)上样流速0.3ml/min(注意蛋白浓度不宜过高,蛋白总量不得超过柱子载量)接一次流穿液,(取样电泳)流穿液也再过一次柱子,接二次流穿液,留样电泳
一般可溶性蛋白:
过一次柱子就可以将目的蛋白完全吸附,这与柱子有一定关系,第一次操作,最好将一次流穿液再过一便柱子。
3)washbuffer(含20mM咪唑)洗脱杂蛋白0.8ml/min,洗脱至少100ml,直到蛋白吸收曲线变平为止(取30μL电泳分析)
4)Elutionbuffer洗脱目的蛋白(含250mM咪唑)
Elutionbuffer:
8.0过滤0.22μm除气
流速0.3ml/min收集蛋白收集峰值每管2ml
5)washbuffer平衡柱子(不含咪唑)流速1ml/min
6)保存柱子时用20%酒精,4℃
7)对纯化的样品电泳分析纯度,紫外分光度法定量
蛋白浓度(mg/ml)=1.45×
OD280-0.74×
OD260
蛋白1:
1000分别加入:
0.1MPMSF
0.5MEDTA100×
PH:
7.5(即储存液为100×
,加入终浓度为1×
)
5ML-Arginine100×
PH:
分装-20℃保存
不可溶性蛋白纯化
1)沉淀用30mlbufferB溶解后,13000rpm离心15min上清过0.22μm的滤膜
2)BufferB平衡柱子(不含咪唑)流速1ml/min
BufferBNaH2PO420mM;
Nacl500mM;
Urea8M;
PH:
3)上样流速0.3ml/min(注意蛋白浓度不宜过高,蛋白总量不得超过柱子载量)接一次流穿液,(取样电泳)流穿液重复3-4次过柱子每次的流穿液都要留样电泳分析
不可溶性蛋白一般浓度较高,一次不能让柱子充分吸附,所以流穿液重复上样
4)BufferC洗脱杂蛋白,流速0.8ml/min,洗脱至少100ml,直到蛋白吸收曲线变平为止,
可用考马斯亮蓝G-250监测
BufferCNaH2PO420mM;
Nacl500mM;
6.8(含咪唑终浓度10mM),一般咪唑现用现加,配好的2M咪唑分装-20℃保存
5)BufferD洗脱目的蛋白(含100mM咪唑)流速0.3ml/min
NaH2PO420mM;
8.0(咪唑终浓度为100mM)
6)收集目的蛋白,收集峰值,2ml/管
7)蛋白跑电泳分析,含目的蛋白的管子合在一起,透析复性。
8)BufferB平衡柱子(不含咪唑)流速1ml/min
9)保存柱子时用20%酒精,4℃
不可溶性蛋白复性
1)根据蛋白分子量大小,选择合适的透析袋水煮30min-1h
2)检查透析袋是否漏,将蛋白装入透析袋中透析,透析每12h换一次透析液
具体操作:
6MUre
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 表达 纯化 总结 教学 提纲
![提示](https://static.bdocx.com/images/bang_tan.gif)