牛奶中金黄色葡萄球菌的检测综述Word文档格式.docx
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葡萄球菌的检验方法,观察金黄色葡萄球菌的革兰氏染色镜检形态。
(3)掌握金黄色葡萄球菌增菌培养技术、分离技术、鉴定技术。
国内外研究现状:
金黄色葡萄球菌是院内感染的常见细菌之一,许多国家都设有专门机构,应对金葡菌的院内感染问题。
随着?
-内酰胺类抗生素的广泛应用,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA随)之增加,且引起的感染和病死率有逐年增加的趋势。
MRSA可通过接触途径进行传播,即易感人群从携带者或感染者身上获得MRSA,导致传播流行。
美国第一例MRSA发现于1968年,1975年MRSA在临床分离出的金葡菌中仅占2.4%,而1991年则迅速增至29%。
现在美国的某些医院MRSA在临床分离出的金葡菌中可以占到30%-50%。
同样在欧洲的葡萄牙和意大利,MRSA在临床分离出的金葡菌中占50%;
土耳其和希腊>
30%。
荷兰非常低,只有2%,这归功于荷兰人行之有效的控制策略。
在欧洲的调查中,瑞士的流行率最低(1.8%),这主要由于他们在医院内实行了一些新的干预行为,如坚持医护人员的手部卫生管理,以减少MRSA的传播。
在北欧国家MRSA在临床分离出的金葡菌中不足1%。
在芬兰MRSA是非常少见的,直到20世纪90年代医院的病人中只有散发的病例,近几年有报道由不同的流行株引起的医院感染暴发。
同时,MRSA在社区感染中所占的比例也不断增加。
1997年日本报道了第一例耐万古霉素的金葡菌(vancomycin-intermediatestaphylococcusau-reus.VIS)A,表明金葡菌的耐药问题日益严重。
国内情况:
上海地区1977~1979年MRSA占5%,1985~1986年占24%,1990年综合性大医院增至50%,而1993年则上升到60%。
重庆地区1983~1985年为8.3%,1989~1992年上升为18.7%;
1995年北京5家教学医院MRSA分离率平均为47%。
广州地区1990~1995年临床分离的MRSA占金黄色葡萄球菌的比例分别为17.9%、23.5%、30.9%、41.6%、51.9%及56.18%。
其它地区的报道也一般在25%~60%之间,各个地区和医院的MRSA检出率都明显有逐年增加的趋势。
主要参考文献:
(1)《食品微生物检验》(第1版),国家质量监督检验检疫总局职业技能鉴定指导中心主编.北京:
中国计量出版社.2002.
(3)《食品卫生微生物检验标准手册》(第1版),罗雪云、刘宏道主编.北京:
中国标准出版社.1995.
(4)《食品卫生微生物学检验》2003版中华人民共和国国家标准.中华人民共和国卫生部中国国家标准化管理委员会发布
(5)《药品微生物学检验手册》马绪荣苏德模等主编.科学出版社.2001.
(6)《食品中金黄色葡萄球菌检测方法研究进展》唐俊妮、杨蓉生(1.西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;
王小玲(2.西南民族大学电气信息工程学院,四川成都610041)中图分类号:
TS207.4文献标识码:
A文章编号:
1002-0306(2011)05-0459-03
(7)GB/T4789.食品卫生微生物学检验[S].
(8)陈敏,王颖,顾其芳.巧克力中金黄色葡萄球菌存活及产毒情况观察[J].中国卫生检验杂志,2000,10(5):
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(9)徐景野,等.棒冰中金黄色葡萄球菌存活观察[J].中国卫生检验杂
志,1998,8(5):
293.
(10)汪复,朱德妹,张婴元.上海部分医院细菌耐药监测及其临床意义.中华传染病杂志,1996,14(3):
148.
二、研究内容、预期成果:
研究内容:
1、形态与染色:
典型的金黄色葡萄球菌为球型,直径0.8μm左右,显微镜下排列成葡萄串状。
金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛,大多数无荚膜。
2、培养特性:
金黄色葡萄球菌营养要求不高,在普通培养基上生长良好,需氧或兼性厌
氧,最适生长温度37°
C,最适生长pH7.4。
平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起,直径1-2mm。
血平板菌落周围形成透明的溶血环。
金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性,可在10-15%NaCl肉汤中生长。
3、生化特性:
可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖,产酸不产气。
甲基红反应阳性,VP反应弱阳性。
许多菌株可分解精氨酸,水解尿素,还原硝酸盐,液化明胶。
金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力,对磺胺类药物敏感性低,但对青霉素、红霉素等高度敏感。
对分型进行简单的了解1、血清学分型:
金葡水解,获得两种抗原成分:
蛋白抗原和多糖抗原。
蛋白抗原是凝集抗原,无特异性。
多糖抗原有特异性。
绝大多数金葡含有A型抗原,B型抗原主要存在于凝固酶阴性菌株,C型抗原在致病性和非致病性菌株中都存在。
2、噬菌体分型:
3、根据肠毒素分型:
4、根据血浆凝固酶分型:
金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌,可引起局部化脓感染,也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等,甚至败血症、脓毒症等全身感染。
金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶:
a.溶血毒素:
外毒素,分α、β、γ、δ四种,能损伤血小板,破坏溶酶体,引起肌体局部缺血和坏死;
b.杀白细胞素:
可破坏人的白细胞和巨噬细胞;
c.血浆凝固酶:
当金黄色葡萄球菌侵入人体时,该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固,阻碍吞噬细胞的吞噬作用。
葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关;
d.脱氧核糖核酸酶:
金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温,可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌;
e.肠毒素:
金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素,分为A、B、C、D、E及F五种血清型。
当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品,如牛奶和奶制品、肉、蛋等,在温度条件适宜时,经8-10小时即可相当数量的肠毒素。
肠毒素可耐受100°
C煮沸30分钟而不被破坏,它引起的食物中毒症状是呕吐和腹泻。
此外,金黄色葡萄球菌还产生溶表皮素、明胶酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶
等。
预期结果:
革兰氏阳性菌染色为蓝色,革兰氏阴性菌染色为红色,金黄色葡萄球菌革兰氏染色为阳性。
三、研究方法和进度安排:
1.研究方法:
(1).革兰氏染色:
1.1涂片、火焰固定。
1.2草酸铵结晶紫染1min。
草酸铵结晶紫染液的配制:
溶液A:
结晶紫2g,95%酒精20mL,溶液B:
草酸铵0.8g,蒸馏水80mL。
将A、B溶液混合,用滤纸过滤后即可使用。
1.3自来水冲洗。
1.4加碘液覆盖涂面染约1min。
1.5水洗,用吸水纸吸去水分。
1.6加95%酒精数滴,并轻轻摇动进行脱色,20s后水洗,吸去水分。
1.7沙黄液(稀)染2min后,自来水冲洗。
干燥,镜检。
革兰氏阳性菌染色为蓝色,革兰氏阴性菌染色为红色
(2).触酶试验:
取槽置于洁净的试管内或玻片上,然后加3%过氧化氢数滴;
或直接滴加3%过氧化氢于不含血液的细菌培养物中,立即观察结果。
有大量气泡产生者为阳性,无则为阴性。
2.样品采集:
选取怀疑有金黄色葡萄球菌感染的牛奶进行试验,将其每样取5ml于无菌乳样杯中,待检。
3病原菌的分离培养初步诊断:
将少量乳汁涂片、革兰氏染色、镜检。
如发现圆球形革兰氏阳性细菌可怀疑为葡萄球菌。
分离培养:
将乳样摇匀,分别取适量接种于营养肉汤(10%血清)、鲜血琼脂、麦康凯琼脂培养基(平板)后,置于37℃温箱培养24~48h。
观察每个平板中细菌生长的情况,记录菌落生长表现。
普通琼脂平板上,37℃,24~72h培养后,可见到湿润、光滑、隆起的圆形金黄色菌落。
挑取典型菌落涂片、染色、镜检(镜检呈葡萄状排列,无芽胞、荚膜,直径0.5~lμm,革兰氏染色阳性),并挑取单个可疑菌落移植于肉汤和斜面培养基,经37℃培养24~48h。
24h后没有长菌的平板,再用相应的增菌肉汤涂划一次,继续培养,24~48h后,再作检查,以防漏检。
将剩余的乳样存放于4℃冰箱内备用。
营养肉汤中呈浑浊生长,管底有少量灰白色沉淀;
4生化鉴定
触酶试验:
触酶阳性
糖发酵试验:
能分解甘露醇、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖
色素产生情况:
能产生金黄色色素
5毒力试验
将上述经过生化试验鉴定的细菌悬液用灭菌生理盐水作适当稀释,对随机分组的小鼠进行腹腔注射接种,接种量为0.5mL/只(家兔皮下接种1.0mL或者静脉接种0.1~0.5mL),能够致死动物或者内脏出现脓肿可以确定有毒力。
6病原菌的重分离试验
对接种后发病、死亡小鼠(家兔)的肝脏进行病原菌重分离。
进行菌落涂片、革兰氏染色、显微镜检查,观察所分离菌株是否为原接种菌。
如果是则进一步确定病原菌为金黄色葡萄球菌。
第一,金黄色葡萄球菌的检验
样品处理:
无菌取25g或25mL食品样品,放入225mL灭菌生理盐水中均质,制成10-1稀释液。
增菌培养:
将10-1稀释液接入7.5%NaCl肉汤或胰蛋白胨肉汤中,37°
C培养24小时。
将上述稀释液或培养液分别划线血平板和Baird-Parker平板,置37°
C培养24~48小时。
金黄色葡萄球菌在血平板上呈金黄或白色菌落,大而凸起,表面光滑,周围有溶血圈。
在Baird-Parker平板上菌落为圆形,直径2~3mm,颜色灰或黑色,周围有一浑浊带。
染色观察:
从平板上挑取可疑性菌落进行革兰氏染色,金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性,显微镜下呈葡萄状排列的芽孢、荚膜,直径0.5~1μm。
第二,金黄色葡萄球菌肠毒素检测
金黄色葡萄球菌肠毒素的检测主要有动物试验、血清学实验、免疫荧光试验及酶联免疫吸附等方法。
2.进度安排:
2012年07月09日
四、拟利用本实验室的名称及试剂需要:
实验室名称:
微生物实验室
试剂:
牛奶、结晶紫2g,95%酒精20mL,草酸铵0.8g,蒸馏水80mL、番红
染液生理盐水琼脂
五、审批意见:
教师姓名
职称
年月日
学生签名
- 配套讲稿:
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