Myostatin干扰质粒的构建及在C2C12细胞中的成效验证Word文件下载.docx
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结果:
构建的3个阳性干扰质粒中M1/pSilencer能显著降低C2C12细胞中Myostatin表达量,随着M1/pSilencer干扰质粒剂量的增加,Myostatin表达量慢慢降低。
结论:
成功构建MyostatinRNAi质粒,该质粒能下调目的基因Myostatin在C2C12细胞中的表达量。
【关键词】Myostatin;
RNA干扰;
C2C12
[Abstract]Objective:
ToevaluatetheroleofRNAinterference(RNAi)insilencingMyostatinexpressioninmouseC2C12cells(myoblast).Methods:
ThreetargetsequencesandanegativesequencewereselectedaccordingtoMyostatinmRNAsequence,thecomplementaryDNAcontainedbothsenseandantisenseoligonueleotidesweredesignedandsynthesized.Afterannealing,thedoublestrandsDNAwereligatedtothesiRNAexpressionvector.ThreepositiveRNAiplasmidsnamedM1/pSilencer,M2/pSilencer,M3/pSilencer,andthenagetiveplasmidnamedMc/pSilencerweretransfectedintotheC2C12cells,inwhichthesilencingeffectonMyostatinexpressionwasinvestigatedbyreal-timePCRandWesternblot.Results:
AmongthethreeRNAipositiveplasmids,theM1/pSilencercouldreduceMyostatinexpressionsignificantly.WiththedoseofplasmidM1/pSilencerincreasing,theexpressionofMyostatinandmRNAdecreased.Conclusion:
TheresultsindicatedthatMyostatinRNAiplasmidswereobtained,andtheRNAiplasmidscouldreduceMyostatinexpressioninC2C12cells.
[Keywords]Myostatin;
RNAi;
1997年美国JohnsHopkins大学的研究人员从小鼠骨骼肌cDNA文库中克隆出Myostatin。
蛋白质同源性比较证明Myostatin是TGF-β超家族的新成员,又称生长分化因子8。
在Myostatin敲除的小鼠体内,肌纤维发生普遍的增生和肥大,致使骨骼肌肌肉质量显著增加[1~4]。
Myostatin编码序列发生突变的牛也显现肌肉质量显著增加,呈现“双肌现象”[5,6]。
由此可见,Myostatin能抑制骨骼肌的生长,是骨骼肌生长的负性调控因子[3,7]。
咱们以前的研究说明,在座骨神经缺损后,失神经支配的腓肠肌MyostatinmRNA和蛋白具有特定的表达模式[8,9],提示Myostatin在失神经性肌萎缩进程中扮演重要角色。
为了进一步探讨Myostatin在失神经肌萎缩中的生物学作用,本实验构建小鼠MyostatinRNAi质粒,采纳WesternBlot及荧光定量PCR法,验证Myostatin干扰质粒在小鼠骨骼肌成肌细胞系C2C12细胞中的沉默作用。
1材料和方式
细胞及要紧试剂C2C12细胞株,购自北京军事医学科学院。
DMEM,Lipofectamin2000(Invitrogen),胰蛋白酶(Sigma),胎牛血清(杭州四季青),表达载体(Ambion公司),限制性内切酶BamHⅠ,HindⅢ(TaKaRa公司),细胞蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂、BCA蛋白定量试剂盒(上海申能博采生物科技),兔抗小鼠Myostatin多抗(Chemicon),IRDye800偶联的驴抗兔及驴抗羊IgG(H&
amp;
L,Rockland,USA),羊抗小鼠GAPDH多抗(SantaCrus)。
C2C12细胞的培育C2C12细胞接种于含DMEM完全培育基(10%胎牛血清)的培育皿中,置于5%CO二、饱和湿度、37℃培育箱内培育。
2天换液1次。
实验所用的细胞均处于对数生长期。
MyostatinRNAi质粒构建依照小鼠MyostatinmRNA序列(注册号为NM_010834)取得3对来自Ambion公司的siRNA序列信息,按ID#156380的序列,将碱基序列重排,经GenBankBLAST检索,不与小鼠任何基因同源,作为阴性对照的序列(表1),依照发夹siRNA的组成方式,设计siRNA模板,包括各正反义靶序列的互补DNA链、限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ识别序列(表2),上述4对RNAi序列由上海鼎安生物科技合成。
用TE溶解siRNA模板寡核苷酸,浓度至1μg/μl。
SiRNA模板核苷酸的退火:
反映在灭菌的ml离心管中进行,依次加入:
sensesiRNA模板核苷酸2μl,antisensesiRNA模板核苷酸2μl,2×
DNAAnnealingSolution25μl,反映整体系50μl,轻轻混匀,略加离心。
90℃3min后,37℃1h,退火的siRNA模板链-20℃保留备用。
将5μl模板链加入45μl双蒸水中,终浓度为8ng/μl。
模板链与载体的连接,依次加入:
10×
连接酶缓冲液1μl,载体1μl,模板链1μl,T4DNA连接酶1μl。
反映整体系10μl,轻轻混匀,略加离心。
4℃,留宿。
连接产物的转化,重组质粒的挑选,抽提,测序证明后测定A260,对证粒进行定量,-20℃保留备用。
MyostatinRNAi质粒转染C2C12细胞细胞处置:
转染前24h将培育的C2C12细胞以%胰蛋白酶消化,用不含抗生素的DMEM完培终止反映,接种于24孔培育板,使转染当天细胞融合达80%~85%。
转染:
四个质粒均依照lipofectamin2000操作说明,依照1μg质粒和2μllipofectamin2000/孔进行转染。
4~6小时后换生长培育基(DMEM+10%胎牛血清)。
24小时后扩至6孔培育板,继续培育至72小时,收成细胞。
实时荧光定量PCR检测成肌细胞系C2C12中myostatinmRNA表达的转变转染72h后Trizol法提取C2C12总RNA,RT-PCR合成第一链,将1μlcDNA模板加入19μl定量PCR反映液(含1×
PCRBuffer、mmol/LMgCl二、mmol/LdNTPs、Myostatin或GAPDH上下游引物各μmol/L、Myostatin或GAPDH荧光探针各μmol/L、TaqDNA聚合酶1U),混匀后加入专用离心管中,并设空白管、阴性对照和Myostatin或GAPDH各5个标准品对照(浓度别离为10五、104、103、10二、101pg/ml)。
各反映管于荧光定量PCR仪进行扩增:
94℃预变性2min,然后94℃20s,60℃60s,共40个循环。
依照各自标准品成立的标准曲线,由软件自动计算出待测样本中Myostatin或GAPDH的准确含量。
为了排除样本、逆转录和PCR反映的不同,以MyostatinmRNA和GAPDHmRNA含量的比值作为评判Myostatin表达水平的指标。
相同实验重复4次。
Western-Blot检测成肌细胞系C2C12中myostatin表达的转变转染72h后总蛋白提取及蛋白浓度测定:
移去培育基,以预冷的PBS漂洗一遍。
移去PBS,加入细胞蛋白裂解液及蛋白酶抑制剂提取总蛋白。
采纳BCA法测定总蛋白浓度。
12%SDS-PAGE电泳,采纳半干转移至PVDF膜,封锁后,别离采纳兔抗鼠myostatin单克隆抗体(1∶500)或山羊抗鼠GAPDH单克隆抗体(1∶300),一抗,4℃留宿。
相应二抗为IRDye800偶联的驴抗兔IgG,IRDye800偶联的驴抗羊IgG,显色后,OdysseyInfraredImagingSystem(Rockland,USA)进行灰度扫描,PDQuest软件分析结果。
以myostatin和GAPDH扫描灰度的比值作为评判myostatin蛋白水平的指标,相同实验重复4次。
统计学方式应用统计分析软件对样本数据进行t查验,并别离计算均数(x)和标准差(s),所得结果表示为x±
s,显著性不同的概率设为P&
lt;
。
2结果
双链siRNA构建退火后形成的双链siRNA,产物经电泳鉴定,条带位置与预期扩增加度相符,分子量66bp左右。
siRNA重组质粒酶切鉴定4对siRNA模板链与载体的连接,转化DH5α感受态细胞,从而取得重组质粒,3个阳性质粒别离命名为M1/pSilencer、M2/pSilencer、M3/pSilencer,阴性对照质粒命名为Mc/pSilencer,在BamHI、HindⅢ酶切取得66bp,证明有双链siRNA的插入。
经测序证明与原序列相符。
转染后C2C12细胞Myostatin的表达WesternBlot检测转染不同Myostatin干扰质粒后C2C12细胞Myostatin蛋白含量,结果见图1。
结果显示,与阴性质粒对照,M1/pSilencer质粒能显著减少C2C12细胞Myostatin蛋白表达(P&
转染不同剂量干扰质粒C2C12细胞MyostatinmRNA及其蛋白的表达转变实时荧光定量PCR和WesternBlot检测转染不同剂量(μg、μg、μg)M1/pSilencer质粒后,C2C12细胞中MyostatinmRNA和蛋白含量,结果见图二、3。
结果说明,M1/pSilencer干扰质粒对C2C12细胞Myostatin的表达具有沉默作用,该作用存在着剂量效应关系,随着其剂量的增加,下调C2C12细胞MyostatinmRNA和蛋白表达作用越明显。
3讨论
C2C12细胞是小鼠成肌细胞系,在必然的条件下可诱导分化为骨骼肌细胞,是一种较好的用于研究肌细胞增殖及分化有关因子的模型。
本研究采纳RNA干扰技术构建Myostatin干扰质粒,并观看其在C2C12细胞中抑制靶基
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- Myostatin 干扰 质粒 构建 C2C12 细胞 中的 成效 验证