三种荧光定量PCR检测方法比较.docx
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三种荧光定量PCR检测方法比较
三种荧光定量PCR检测方法比较
三种荧光定量PCR检测方法比较
定量pcr:
以参照物为标准,对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测,从而达到评估样本中靶基因的拷贝数,称为定量PCR。
定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。
常见荧光定量PCR检测方法可分为以下几类:
(1)SYBRGreenI检测模式
SYBRGreenI是一种能与双链DNA结合发光的荧光染料。
其与双链DNA结合后,荧光大大增强。
因此,SYBRGreenI的荧光信号强度与双链DNA的数量相关,可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。
SYBRGreenI的最大吸收波长约为497nm,发射波长最大约为520nm。
PCR扩增程序一般为94℃~55℃~72℃三步法,40个循环。
SYBRGreenI的缺点:
由于SYBRGreenI没有特异性,不能识别特定的双链,只要是双链就会结合发光,对PCR反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光,通常本底较高,所以在临床上使用可能会有假阳性发生。
SYBRGreenI的优点:
SYBRGreenI的优点是因为其缺点产生,由于它能所有的双链 DNA相结合,所以对不同模板不需特别定制不同的特异性探针,通用性较好,并且价格相对较低。
这对科研是很有利的,因此国内外在科研中使用比较普遍。
(2)水解探针模式(taqman探针)
TaqMan探针是一种寡核苷酸探针,荧光基团连接在探针的5’末端,而淬灭剂则在3’末端。
当探针与靶序列配对时,荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。
在进行延伸反应时,聚合酶的5’外切酶活性将探针切断,使得荧光基团与淬灭剂分离,发射荧光。
一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。
随着扩增循环数的增加,释放出来的荧光基团不断积累。
因此Taqman探针检测的是积累荧光。
PCR扩增程序通常是:
94℃~60℃40个循环。
常用的荧光基团是FAM,TET,VIC,HEX。
(3) 杂交探针模式(Beacon、FRET)
分子信标是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针,两端的核酸序列互补配对,因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。
荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭,由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。
分子信标的茎环结构中,环一般为15-30个核苷酸长,并与目标序列互补;茎一般5-7个核苷酸长,并相互配对形成茎的结构。
荧光基团标记在探针的一端,而淬灭剂则标记在另一端。
在复性温度下,因为模板不存在时形成茎环结构,当加热变性会互补配对的茎环双链解开,如果有模板存在环序列将与模板配对。
与模板配对后,分子信标将成链状而非发夹状,使得荧光基团与淬灭剂分开。
当荧光基团被激发时,因淬灭作用被解除,发出激发光子。
由于是酶切作用的存在,分子信标也是积累荧光。
常用的荧光基团:
FAM,TexasRed。
PCR扩增程序通常是:
94~55~72℃三步法,40个循环。
FRET探针又称双杂交探针,FRET探针由两条相邻探针组成,在一条探针的5`端标记FAM荧光基团,另一探针的3`端标记Red640荧光基团。
当复性时,探针结合在模板上,FAM基团和Red640基团相邻,激发FAM产生的荧光,作为Red640基团的激发光被吸收,使Red640发出波长为640的荧光。
当变性时,探针游离,两基团距离远,不能产生640波长的荧光。
由于FRET探针是靠近发光,所以检测信号是实时信号,非累积信号。
常用的荧光基团是:
LC-Red640,LC-Red705。
能用于实时荧光PCR定量的方法很多,各有优缺点,应根据实验的需要和当前的实验条件选择适合自己的方法。
下面为各种方法的比较:
实验中的一些好习惯:
加入试剂之前,把它混匀一下,以免放置时间长了浓度不均;移液枪用完之后要归到最大计量的位置,防止久而久之弹簧失去弹性。
一定要记着关水浴箱,切记切记;多和大家讨论,同时多关注别人讨论的经验,这几乎是最快提高的捷径了;所有的试剂都自己配,出了问题才好找原因。
防止RNA酶污染的措施:
1.所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6h或更长时间。
2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意:
有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能使用)。
3.有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在3%H2O2室温10min,然后用0.1%DEPC水冲洗,晾干。
4.配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC,在37℃处理12h以上。
然后用高压灭菌除去残留的DEPC。
不能高压灭菌的试剂,应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制,然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换。
6.设置RNA操作专用实验室,所有器械等应为专用。
常用的RNA酶抑制剂:
1.焦磷酸二乙酯(DEPC):
是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。
它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,从而抑制酶的活性。
2.异硫氰酸胍:
目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂,它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。
它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对RNA酶有强烈的变性作用。
3.氧钒核糖核苷复合物:
由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制RNA酶的活性。
4.RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin):
从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。
RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种RNA酶结合,使其失活。
5.其它:
SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。
因为DEPC不加选择的修饰蛋白质和RNA,因此在分离和纯化RNA过程中不能使用,而且它与一些缓冲液(例如Tri)不能相容
在所有RNA实验中,最关键的因素是分离得到全长的RNA。
而实验失败的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。
RNA酶可耐受多种处理而不被灭活,如煮沸、高压灭菌等。
研究人员造成的污染RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。
因此进行RNA实验时应勤换手套。
但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理
动植物总RNA提取-Trizol法:
Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌,样品量从几十毫克至几克。
用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。
RNA可直接用于Northern斑点分析,斑点杂交,Poly(A)+分离,体外翻译,RNase封阻分析和分子克隆。
1.将组织在液N中磨成粉末后,再以50-100mg组织加入1mlTrizol液研磨,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
2.研磨液室温放置5分钟,然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒。
3.取上层水相于一新的离心管,按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇,室温放置10分钟,12000g离心10分钟。
4.弃去上清液,按每mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,涡旋混匀,4℃下7500g离心5分钟。
5.小心弃去上清液,然后室温或真空干燥5-10分钟,注意不要干燥过分,否则会降低RNA的溶解度。
然后将RNA溶于水中,必要时可55℃-60℃水溶10分钟。
RNA可进行mRNA分离,或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。
[注意]
1.整个操作要带口罩及一次性手套,并尽可能在低温下操作。
另外,提取上清这步一定要小心,靠近沉淀的部分一定要舍得不要,要不然会有蛋白质污染,影响比值
2.加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上,RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周,-20℃保存一年。
总mRNA的提取经验:
一、关于TrizolReagent需要的试剂
1.Chloroform:
氯仿(分析纯)
2.Isoproplylalcohol:
异丙醇(分析纯)
3.75%Ethanol(inDEPC-treatedwater):
75%乙醇。
要求用分析纯无水乙醇并用0.01%的DEPC处理过的无Rnase的水稀释。
4.RNase-freewater:
无Rnase的水。
方法是:
将DEPC按0.01%(V/V)加在dH2O中500ml(50ul),在37℃过夜,并高压灭菌即得(150℃3小时)
5.一次性塑料手套
6.注意:
DEPC有致癌之嫌
二、关于TrizolReagent的使用过程:
1.Homogenization(匀浆)
a.Tissues:
组织
每100mg组织匀浆加1mlTrizol试剂,样品体积不能超过Trizol试剂的10%。
b.CellsGrowninmonolayer(单层细胞接毒后出现病变的)
针对JEV细胞总RNA的抽提法:
BHK21细胞长成单层后,接毒0.5-1ml(采用大瓶),37℃吸附1h,倒掉,加维持液(含2%的血清和HEPE8的MEM)约5ml,维持天。
出现75%-100%的病变时,以PBS(预冷)冲洗细胞两次,直接在细胞瓶中加入Trizol试剂1ml/10cm2,吹吸几次,以裂解细胞(细胞瓶有两种常用规格:
大的约45cm2,小的约30cm2,故所用Trizol试剂分别约为4.5ml和3ml。
Trizol试剂的加入是依细胞瓶而定,以盖满瓶底为度,而不是依据细胞的数量,否则可导致DNA的污染)具体方法如下:
(样品一定要新鲜)
(1)组织接入预冷的EP管中,加入Trizol试剂1ml/10cm2(量一定要加足,否则易污染),混匀,吹吸几次,以破裂细胞,置室温5min,以使核蛋白复合物彻底分离。
(2)加氯仿0.2ml(每1mlTrizol试剂加入氯仿0.2ml),盖好,剧烈震荡15s,置室温2-3分钟。
(3)4℃离心,10000g×15min,离心后,混合物将分离为底层为浅红的、中层为酚-氯仿相、上层为无色的水相。
RNA包含在水相中,水相的体积约相当于所加的Trizol试剂量的60%。
(4)仔细吸取上层水相,移至另一EP管中。
(5)加0.5ml异丙醇,以沉淀RNA(每1mlTrizol试剂加入0.5ml异丙醇),置室温10min。
(6)4℃离心,10000g×10min。
RNA沉淀为一层如凝胶样透明的小块附在管底和管壁。
(7)弃上清液,加入预冷的75%乙醇1ml(每1mlTrizol试剂加入75%乙醇至少1ml),震荡,充分洗涤沉淀,4℃离心,5500g×5min。
弃上清液,空气干燥(或真空干燥)后,沉淀重悬于无RnasedH2O中,吹吸几次,55℃-60℃作用10分钟以溶解RNA,-70℃保存备用。
(8)抽提出的细胞总RNA干燥后加水50ul,取10ul加无Rnase水990ul,稀释100倍成1ml。
于0.5cm厚的石英比色杯中,以无Rnase水为对照,在721型紫外分光光度计下检测,结果应为:
A260/280ratio<1.6。
(9)分离组织10mg(纯组织)加800ulTrizol试剂。
(10)扩增产物的鉴定。
DEPC处理方法如下:
1.DEPC处理:
(1)DEPC水:
100ml超纯水加入0.2mlDEPC,充分混匀,高压灭菌。
(2)Tip头(枪头)、EP管等在提RNA过程中及做RT时接触RNA的器材(包括1ml、200μl、20μlTip头;EP管和PCR反应管等):
用0.1%的DEPC水(1000ml
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