常用紫外分光光度法测定蛋白质含量.docx

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常用紫外分光光度法测定蛋白质含量

6种方法测定蛋白质含量

一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法

样品与浓硫酸共热。

含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。

经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。

若以甘氨酸为例，其反应式如下：

nh2ch2cooh+3h2so4——2co2+3so2+4h2o+nh3

（1）

2nh3+h2so4——（nh4）2so4

（2）

（nh4）2so4+2naoh——2h2o+na2so4+2nh3（3）

反应

（1）、

（2）在凯氏瓶完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。

为了加速消化，可以加入cuso4作催化剂，k2so4以提高溶液的沸点。

收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。

实验和计算方法这里从略。

计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白

氮即得。

如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。

二、双缩脲法（biuret法）

（一）实验原理

双缩脲（nh3conhconh3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。

在强碱性溶液中，双缩脲与cuso4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。

凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。

测定围为1-10mg蛋白质。

干扰这一测定的物质主要有：

硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。

主要的缺点是灵敏度差。

因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

（二）试剂与器材

1.试剂：

（1）标准蛋白质溶液：

用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。

如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。

牛血清清蛋白用h2o或0.9%nacl配制，酪蛋白用0．05nnaoh配制。

（2）双缩脲试剂：

称以1.50克硫酸铜（cuso4•5h2o）和6.0克酒石酸钾钠（knac4h4o6•4h2o），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10%naoh溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或壁涂以石蜡的瓶中）。

此试剂可长期保存。

若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。

2.器材：

可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。

（三）操作方法

1.标准曲线的测定：

取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。

充分摇匀后，在室温（20～25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。

用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。

取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。

2、样品的测定：

取2～3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。

注意样品浓度不要超过10mg/ml。

三、folin—酚试剂法（lowry法）

（一）实验原理

这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。

过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。

此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。

这两种显色反应产生深兰色的原因是：

在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。

folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。

在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。

folin—酚试剂法最早由lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。

以后在生物化学领域得到广泛的应用。

这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。

对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰lowry反应。

而且对后者的影响还要大得多。

酚类、柠檬酸、硫酸铵、tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。

浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。

含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。

若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1～2倍。

进行测定时，加folin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性ph条件下稳定，但上述还原反应只在ph=10的情况下发生，故当folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。

此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。

此法可检测的最低蛋白质量达5mg。

通常测定围是20~250mg。

（二）试剂与器材

1.试剂

（1）试剂甲：

（a）10克na2co3，2克naoh和0.25克酒石酸钾钠（knac4h4o6•4h2o）。

溶解于500毫升蒸馏水中。

（b）0.5克硫酸铜（cuso4•5h2o）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（a）与1份（b）混合，即为试剂甲。

（2）试剂乙：

在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（na2wo4•2h2o）,25克钼酸钠（na2moo4•2h2o）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸锂（li2so4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。

冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。

稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。

使用时用标准naoh滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1n左右。

（3）标准蛋白质溶液:

精确称取结晶牛血清清蛋白或g—球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250mg/ml左右。

牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9%nacl溶液。

2.器材

（1）可见光分光光度计

（2）旋涡混合器

（3）秒表

（4）试管16支

（三）操作方法

1.标准曲线的测定：

取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。

用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。

再逐管加入0.5毫升试剂乙（folin—酚试剂），同样立即混匀。

这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。

然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。

以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。

注意：

因lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。

全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。

待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。

每分钟测一个样品。

进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。

表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。

最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。

folin—酚试剂法实验表

管号12345678910

标准蛋白质00.10.20.40.60.81.0

（250mg/ml）

未知蛋白质0.20.40.6

（约250mg/ml）

蒸馏水1.00.90.80.60.40.200.80.60.4

试剂甲5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.0

试剂乙0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5

每管中蛋白质的量（mg）

吸光度值（a700）

2.样品的测定：

取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。

通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。

即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。

如上表中的8、9、10试管。

根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。

注意:

由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。

因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。

四、改良的简易folin—酚试剂法

（一）试剂

1.试剂甲：

碱性铜试剂溶液中，含0.5nnaoh、10%na2co3、0.1%酒石酸钾和0.05%硫酸铜，配制时注意硫酸铜用少量蒸馏水溶解后，最后加入。

2.试剂乙：

与前面的基本法相同。

临用时加蒸馏水稀释8倍。

3.标准蛋白质溶液：

同基本法。

（二）操作步骤

测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同。

只是试剂甲改为1毫升，室温放置10分钟后，试剂乙改为4毫升。

在55℃恒温水浴中保温5分钟。

用流动水冷却后，在660nm下测定其吸光度值。

改良的快速简易法，可获得与folin—酚试剂法（即lowry基本法）相接近的结果。

五、考马斯亮兰法（bradford法）

（一）实验原理

双缩脲法（biuret法）和folin—酚试剂法（lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。

1976年由bradford建立的考马斯亮兰法（bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。

这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。

这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。

考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。

经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。

在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。

bradford法的突出优点是：

（1）灵敏度高，据估计比lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。

这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比lowry法要大的多。

（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。

完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。

由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。

因而完全不用像lowry法那样费时和严格地控制时间。

（3）干扰物质少。

如干扰lowry法的k+、na+、mg2+离子、tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、edta等均不干扰此测定法。

此法的缺点是：

（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以