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微生物发酵实用工艺及其控制简述
微生物发酵工艺与其控制简述
罗宗学
〔大学生命科学学院650091〕
摘要:
根据操作方式不同,发酵工艺分为间歇发酵,连续发酵和流加发酵三种类型,其中流加发酵在生产和科研上应用最为广泛。
在发酵工艺中反映发酵过程变化的参数分为物理参数、化学参数和生物学参数三大类,这些参数的变化直接影响到发酵工业的生产率和产物品质。
本文从对发酵工艺过程影响较大的发酵温度、pH值、溶解氧、泡沫、菌体浓度和基质、发酵时间等6个方面阐述如何进展发酵工艺的控制,为实现发酵产业的经济效益最大化提供必要的理论依据。
关键字:
发酵工艺变化参数影响和控制
发酵是指通过微生物〔或动植物细胞〕的生长培养和化学变化,大量产生和积累专门的代谢产物的过程。
早在2000多年前,我国就有了酿酒、制醋的发酵技术,那时候发酵完全属于天然发酵。
20世纪40年代中期,美国抗菌素工业兴起,大规模生产青霉素,建立了深层通气发酵技术。
1957年,日本微生物生产谷氨酸盐(味精)发酵成功,大大推动了发酵工程的开展。
70年代开始,随着基因工程、细胞工程等生物过程技术的开发,以石油为原料生产单细胞蛋白,使发酵工程从单一依靠碳水化合物(淀粉)向非碳水化合物过渡,从单纯依靠农产品开展到利用矿产资源,如天然气、烷烃等原料的开发。
80年代,随着学科之间的不断交叉和渗透,微生物学家开始用数学、动力学、化工工程原理、计算机技术对发酵过程进展综合研究,人们能按需要设计和培育各种工程菌,在大大提高发酵工程的产品质量的同时,节约能源,降低本钱,使发酵技术实现新的革命。
发酵过程中,为了能对生产过程进展必要的控制,需要对有关工艺参数进展定期取样测定或进展连续测量。
影响发酵过程发的因素很多,包括物理的〔如温度、搅拌转速、空气压力、空气流量、表观粘度、浊度、料液流量等〕,化学的〔如质浓度、pH、产物浓度、溶解氧浓度、氧化复原电位、废气中氧与二氧化碳浓度、核酸量等〕和生物的〔如菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、基质消耗速率、关键酶活力等〕三大类。
根据能否直接用传感器检测,反映发酵过程变化的参数可以分为两类:
一类是可以直接采用特定的传感器检测的参数,如温度、压力、搅拌功率、转速、泡沫、发酵液粘度、浊度、pH、离子浓度、溶解氧、基质浓度等映物理环境和化学环境变化的参数,称为直接参数。
另一类是至今尚难用传感器来检测的参数,如细胞生长速率、产物合成速率和呼吸嫡等生物因素。
这些参数需要根据一些直接检测出来的参数,借助于电脑计算和特定的数学模型才能得到,因此这类参数被称为间接参数。
所有这些参数中,菌体浓度和基质浓度、温度、pH、溶解氧浓度、泡沫、发酵时间等对发酵过程影响较大的。
本文就这几个参数来简要阐述发酵工艺的过程控制。
1.微生物发酵工艺过程概述
微生物代谢类型很多,利用不同微生物对同一种物质进展发酵或者同一种微生物在不同条件下培养所得产物均不一样。
微生物代谢产物的有37个大类,其中16类属于药物。
在菌体对数生长期所产生的产物,如氨基酸、核并酸、蛋白质、核酸、糖类等,是菌体生长繁殖所必需的。
这些产物叫做初级代谢产物,许多初级代谢产物在经济上具有相当的重要性,分别形成了各种不同的发酵工业。
在菌体生长静止期,某些菌体能合成一些具有特定功能的产物,如抗生素。
生物碱、细菌毒素、植物生长因子等。
这些产物与菌体生长繁殖无明显关系,叫做次级代谢产物。
次级代谢产物多为低分子量化合物,但其化学结构类型多种多样,据不完全统计多达47类。
根据微生物对氧的需求、发酵采用的方式,发酵过程的动力学等可以将微生物发酵工艺分为不同的种类。
如按照微生物对氧的需求将发酵分为好痒发酵、厌氧发酵和兼性厌氧发酵三大类。
按照发酵过程的动力学中产物生成与碳源利用消耗关系,发酵过程分为菌体增长与碳源利用相平行的I型〔偶联型〕、菌体生长与产物合成是分开的或只有局部联系的II型〔混合型〕和菌体生长停止后产物才开始形成的III型〔非偶联型〕。
微生物发酵最常见的分类是按照发酵方式的不同将发酵过程分为间歇发酵,连续发酵和流加发酵三种类型。
1.1间歇发酵
间歇发酵又称为分批发酵,是指发酵过程中营养物和菌种一次加人进展培养,直到完毕放出,中间除了空气进人和尾气排出,与外部没有物料交换。
它是传统生物产品发酵常用的发酵方式,除了控制温度和pH与通气以外,不进展任何其他控制。
分批发酵的具体操作是首先对种子罐进展高压蒸汽空罐灭菌,之后投入培养基进展高压蒸汽灭菌,然后接入用摇瓶等预先培养好的种子,进展培养。
在种子罐开始培养的同时,以同样程序进展主培养罐的准备工作。
对于大型发酵罐,一般不在罐对培养基灭菌,而是利用专门的灭菌装置对培养基进展连续灭菌。
种子培养达到一定菌体量时,即转移到主发酵罐中。
发酵过程中要控制温度和pH,对于需氧微生物还要进展搅拌和通气。
主罐发酵完毕即将发酵液送往提取、精制工段进展后处理。
分批发酵的优点是操作简单、投资少;运行周期短,染菌机会减少;生产过程、产品质量较易控制。
缺点是发酵初期营养物过多会抑制微生物的生长,而发酵的中后期又因为营养物减少而降低培养效率。
迄今为止,分批培养是常用的培养方法,广泛用于多种发酵过程。
1.2连续发酵
连续发酵是指以一定的速度向发酵罐添加新鲜培养基,同时以一样的速度流出培养液,从而使发酵罐的液量维持恒定,微生物在稳定状态下生长。
连续发酵使用的反响器可以是搅拌罐式反响器,也可以是管式反响器。
在罐式反响器中,即使加人的物料中不含有菌体,只要反响器含有一定量的菌体,在一定进料流量围,就可实现稳态操作。
罐式连续发酵的设备与分批发酵设备无根本差异,一般可采用原有发酵罐改装。
根据所用罐数,罐式连续发酵系统又可分单罐连续发酵和多罐连续发酵。
连续发酵的稳定状态可以有效地延长分批培养中的对数期。
在稳定的状态下,微生物所处的环境条件,如营养物浓度、产物浓度、pH值等都能保持恒定,微生物细胞的浓度与其比生长速率也可维持不变,甚至还可以根据需要来调节生长速度。
与分批发酵相比,连续发酵优点主要表现在可长期连续进展,生产能力高;缺点是操作控制要求高,投资高、杂菌污染、微生物菌种变异。
连续发酵在工业发酵中应用不多见,只应用于菌种的遗传性质比拟稳定的发酵,如酒精发酵等。
目前主要用于实验室进展发酵动力学研究,如发酵动力学参数的测定,过程条件的优化试验等。
1.3流加发酵
流加发酵也叫补料分批发酵或半连续发酵,是指在微生物分批发酵中,以某种方式向培养系统补加一定物料的培养技术。
它是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术,同时具备两者的局部优点,是一种在工业上比拟常用的发酵工艺。
补料分批发酵通过向培养系统中补充物料,可以使培养液中的营养物浓度较长时间地保持在一定围,既保证微生物的生长需要,又不造成不利影响,从而达到提高产率的目的。
补料分批发酵根据补料方式不同分为单一补料分批发酵和反复补料分批发酵两种类型。
单一补料分批发酵是在开始时投入一定量的根底培养基,到发酵过程的适当时期,开始连续补加碳源或(和)氮源或(和)其他必须基质,直到发酵液体积达到发酵罐最大操作容积后,停止补料,最后将发酵液一次全部放出。
反复补料分批发酵是在单一补料分批发酵的根底上,每隔一定时间按一定比例放出一局部发酵液,使发酵液体积始终不超过发酵罐的最大操作容积,从而在理论上可以延长发酵周期,直至发酵产率明显下降,才最终将发酵液全部放出。
与传统的分批发酵相比,流加发酵具有无菌要求低;菌种变异,退化少;适用围更广等优点。
因此补料分批发酵技术在生产和科研上被广泛运用,包括单细胞蛋白、氨基酸、生长激素、抗生素、维生素、酶制剂、核苷酸、有机酸等几乎整个发酵工业。
2.温度对发酵工艺的影响与其控制
温度对发酵的影响
微生物发酵所用的菌体绝大多数是中温菌,如霉菌、放线菌和一般细菌。
它们的最适生长温度一般在20~40℃。
在发酵过程中,需要维持适当的温度,才能使菌体生长和代谢产物的合成顺利进展。
温度对发酵过程的影响是多方面的,它会影响各种酶反响的速率,改变微生物代谢产物的合成方向,影响微生物的代谢调控机制。
除这些直接影响外,温度还对发酵液的理化性质产生影响,如发酵液的粘度、基质和氧在发酵液中的溶解度和传递速率、某些基质的分解和吸收速率等,进而影响发酵的动力学特性和产物的生物合成。
例如温度升高,气体在溶液中的溶解度减小,氧传递速率改变,影响基质的分解速率。
同时菌体生长快,反响速度快,酶失活快,菌体衰老快,发酵提前完毕。
影响发酵温度变化的因素
发酵热是引起发酵温度变化的主要因素。
发酵热是指发酵过程中释放出来的净热量,以J/(m3•h)。
所谓净热量是在发酵过程中同时存在产热〔微生物分解基质产生热量,机械搅拌产生热量〕和散热〔如罐壁散热、水分蒸发、空气排气带走热量〕,所有产生的热量和散失的热量的代数和叫做净热量。
发酵过程中产热因素有生物热和搅拌热,散热因素有蒸发热和辐射热。
发酵热为产热因素与散热因素之差。
生物热是菌体氧化分解培养基中的营养物质产生大量能量,而自身细胞合成和代谢产物合成未消耗完以热的形式散发出来的能量。
搅拌热是在机械搅拌通气发酵罐中,由于机械搅拌带动发酵液作机械运动,造成液体之间,液体与搅拌器等设备之间的摩擦,产生可观的热量。
蒸发热通气时,引起发酵液的水分蒸发,水分蒸发所需的热量。
辐射热指发酵罐温度与罐外温度不同,发酵液中有局部热量通过罐壁向外辐射的热量。
由于生物热和蒸发热,特别是生物热在发酵过程中随时间变化,因此发酵热在整个发酵过程中也随时间变化,引起发酵温度发生波动。
为了使发酵能在一定温度下进展,要设法进展控制。
根据菌种与生长阶段来选择最适温度
微生物种类不同,所具有的酶系与其性质不同,所要求的温度围也不同。
如黑曲霉生长温度为37℃,谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为30~32℃,青霉菌生长温度为30℃。
在产物分泌阶段,其温度要求与生长阶段又不一样,应选择最适生产温度。
如青霉素产生菌生长的最适温度为30℃,但产生青霉素的最适温度是20℃。
根据培养条件选择最适温度
温度选择还要根据培养条件综合考虑,灵活选择。
比如通气条件差时可适当降低温度,使菌呼吸速率降低些,溶氧浓度也可髙些;培养基稀薄时,温度也该低些,因为温度高营养利用快,会使菌过早自溶。
根据菌生长情况选择最适温度
菌生长快,维持在较高温度时间要短些;菌生长慢,维持较高温度时间可长些。
培养条件适宜,如营养丰富,通气能满足,那么前期温度可髙些,以利于菌的生长。
总的来说,温度的选择根据菌种生长阶段与培养条件综合考虑。
要通过反复实践来定出最适温度
工业生产上的温度控制
工业生产上,所用的大发酵罐在发酵过程中一般不需要加热,因发酵中释放了大量的发酵热,需要冷却的情况较多。
利用自动控制或手动调整的阀门,将冷却水通入发酵罐的夹层或蛇行管中,通过热交换来降温,保持恒温发酵。
如果气温较高,冷却水的温度又高,就可采用冷冻盐水进展循环式降温,以迅速降到最适温度。
因此大工厂需要建立冷冻站,提高冷却能力,以保证在正常温度下进展发酵。
3.pH值对发酵的影响与其控制
3.1pH值影响微生物生长繁殖和代谢的原因
pH值对微生物发酵过程的影响主要是通过对菌体生长和代谢产物合成表现出来的,它对微生物的生长繁殖和产物合成的影响是多方面的。
在发酵过程中,不同的菌种,对pH要求不同;一样的菌种,当pH不同时,会形成不同的产物;菌种生成和发酵的最适pH不同,形成的产物也不同。
归结起来,pH值影响微生物生长繁殖和代谢的原因有以下几个方面:
第一,影响酶的活性,当pH值抑制菌体中某些酶的活性时,会阻碍菌体的新代谢;
第二、pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变,从而改变细胞膜的透性,影响微生物对营养物质的吸收与代谢物的排泄,因此影响新代谢的进展;
第三,pH值影响培养基某些营养成分和中间代谢物的解离,从而影响微生物对这些物质的利用;
第四,pH值不同,往往引起菌体代谢过程的不同,使代谢产物的质量和比例
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