Med19基因沉默对胃癌细胞增殖和细胞周期的影响Word文件下载.docx

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【关键词】胃癌;

Med19;

RNAi;

增殖;

细胞周期

中介体（Mediator）最早发现于酵母菌中，是由多个蛋白质亚基组成的生物大分子复合物，属于RNA聚合酶Ⅱ通用转录装置的基本组分，在真核生物mRNA合成的活化和抑制中发挥关键作用，对RNA聚合酶Ⅱ活力进行调节〔1～3〕。

哺乳动物中介体的亚基组成及其相关活性已经确定，目前已鉴定30余种亚基，其中多数亚基与酵母的中介体亚基存在广泛的同源性〔4，5〕。

Med19是中介体其中一个亚单位，又称为肺癌转移相关蛋白（lungcancermetastasisrelatedproteinl,LCMR1）。

最初由高转移肺癌中克隆得到，已被证实参与细胞信号由胞外向胞内转导。

抑制Med19基因，可引起某些调节细胞生长、细胞分化和凋亡的基因的表达发生改变，提示Med19可能参与细胞周期调控、信号转导或转录调控〔6〕。

本研究利用慢病毒介导的RNAi方法在胃癌MGC803细胞中沉默Med19基因，观察其影响细胞增殖和细胞周期的能力，从而对Med19基因在胃癌中的功能进行验证。

　　1材料与方法

　　1.1Med19基因shRNA慢病毒载体的构建靶向Med19基因的siRNA序列3′AAGGTGAAGGAGAAGCTAAGT5′，由上海生工公司合成短发卡结构的双链DNA（shRNA），重组进入慢病毒质粒pLVTHM，转化大肠杆菌感受态细胞并挑选重组克隆进行菌落PCR鉴定，测序验证后的shRNA慢病毒载体大量扩增，与包装辅助质粒psPAX2、pMD2G共转染至病毒包装细胞293T，12h后换液，转染72h收集细胞上清，并裂解细胞，用微孔滤膜过滤除菌，超速离心后弃上清液，用冰PBS溶液重悬病毒沉淀，得到shRNA慢病毒包装颗粒，有限稀释法通过荧光观察标定病毒滴度。

　　1.2慢病毒介导RNAi沉默Med19基因的效率验证pLVTHMsiMed19载体包装的慢病毒颗粒感染胃癌MGC803细胞，72h后荧光显微镜下观察GFP的表达情况，通过计算在白光下细胞总数与绿色荧光细胞的比值，得到GFP的阳性表达率，可知慢病毒对MGC803细胞感染率达到85%以上。

感染后的第5天抽提细胞总RNA，通过RTPCR法检测shRNA慢病毒对Med19mRNA表达的抑制作用;

同时裂解细胞收集总蛋白，Western印迹法验证Med19蛋白水平表达的变化，确认shRNA慢病毒对Med19基因的阻断效应。

　　1.3MTT方法检测细胞增殖情况实验共分为三组：

shRNA慢病毒感染组（shRNA组，靶向Med19基因的shRNA慢病毒）、非特异性的shRNA阴性对照病毒感染组（NC组，对照序列shRNA慢病毒）和空白对照组（C组，MGC803细胞未作任何处理）。

取对数生长期细胞MGC803细胞接种于96孔板中，计数细胞每孔2000个，每组5个复孔，接种5块复板。

接种第2天加MTT（5mg/ml）10μl/孔，4h后吸出培养基，加入DMSO100μl/孔。

5min后酶标仪检测OD570吸光度值，连续检测5d。

每天一块复板。

根据MTT读值绘制细胞生长曲线。

　　1.4细胞克隆形成实验实验分组同前，shRNA慢病毒感染后的MGC803细胞制备成细胞悬液，接种于6孔板，每孔200个细胞，将接种好的细胞于37℃、5%CO2培养箱中继续培养到绝大多数单个克隆中细胞数大于50为止，中途进行数次换液并进行细胞状态观察，连续观察14d。

实验终止前荧光显微镜下对细胞克隆进行拍照，终止时用PBS溶液洗涤细胞2次，多聚甲醛固定细胞40min，PBS溶液再次洗涤后用GIEMSA染色液对细胞染色10min，去离子水清洗细胞3次去除背景，晾干、拍照和计数克隆。

　　1.5流式细胞仪检测细胞周期实验分组同前，感染shRNA慢病毒的MGC803细胞接种于6孔板中，细胞固定时先用胰酶消化，待细胞呈圆形未脱落时，完全培养基终止，4℃预冷的PBS洗涤细胞沉淀2次，2000r/min、5min收集细胞，然后边震荡边加入70%的冰冷乙醇1ml固定细胞，4℃过夜。

冰PBS洗涤细胞2次后，2000r/min离心5min收集细胞1ml冰PBS溶液重悬细胞沉淀，分别加入PI（1∶40）及RNase（1∶100），避光冰浴15min，上机进行流式检测。

　　1.6统计数据处理数据采用软件SPSS16.0进行统计学分析，应用一维方差分析比较显著性。

　　2结果

　　2.1shRNA慢病毒介导Med19基因沉默效果采用针对Med19基因的PCR引物，以βactin为内参，进行mRNA的定量检测。

shRNA慢病毒感染组（shRNA组）、阴性对照病毒感染组（NC组）和空白对照组（C组）mRNA结果见图1，mRNA水平基因抑制效率达到78.4%。

同时，Western印迹实验结果中同样证实shRNA组Med19蛋白的表达量与NC组相比明显减少，表明shRNA慢病毒感染MGC803细胞后可以高效抑制Med19蛋白的表达，见图1。

　　图1shRNA慢病毒在MGC803细胞中

　　对Med19基因的抑制效率

　　2.2shRNA慢病毒介导Med19沉默抑制胃癌MGC803细胞增殖在MTT实验方法中，OD570nm处的吸光值可间接反映出细胞增殖的情况，即OD570nm值越大，细胞活力越强。

MTT法检测转染后1～5d各组细胞的吸光度值，以培养时间为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制生长曲线。

对各组细胞同一检测点的吸光度值进行统计分析，结果显示，Med19shRNA慢病毒感染组MGC803细胞的570nmOD值显著低于其他两组，表明MED19基因沉默后MGC803细胞增殖明显受到抑制，细胞活力下降，而阴性对照组和空白对照组OD570nm值基本一致，说明慢病毒本身对MGC803细胞增殖能力无影响，从而也证实由于shRNA慢病毒介导了MGC803细胞中Med19基因的沉默导致了细胞增殖能力下降，见图2。

　　图2MGC803细胞增殖曲线

　　2.3Med19基因沉默降低MGC803细胞克隆形成能力从单个克隆看，阴性对照组和空白对照组细胞数目较多且两组相差不大，而shRNA慢病毒感染的MGC803克隆中细胞数比其他两组显著减少，见图3。

同时，克隆计数结果表明，Med19沉默后细胞克隆数（42.7±

7.1）与阴性对照组（124.3±

22.8）和空白对照组（147.3±

28.5）克隆数相比显著降低，表明抑制Med19基因能够降低胃癌MGC803细胞克隆形成能力。

表1PI染色流式细胞仪检测细胞周期结果

　　2.4Med19基因沉默引起MGC803细胞周期阻滞于G1期应用PI染色细胞进行流式细胞术观察Med19基因沉默后对胃癌MGC803细胞周期的变化。

从表1数据可以观察到，与阴性对照相比，抑制Med19能够使G1期细胞增多，G2/M期细胞减少，差异具有显著性。

由此可见Med19基因RNAi后细胞周期阻滞于G1期，细胞复制能力降低，验证了其表达对胃癌细胞具有促进增殖的作用（图4）。

　　图4MGC803细胞周期峰型图

　　3讨论

　　在世界范围内胃癌死亡率居恶性肿瘤第二位，由于饮食结构等因素影响，目前全球约60%的胃癌新发病例发生在中国、日本等东南亚国家。

外科手术是目前胃癌治疗的最有效手段，但术后5年生存率较低。

据2009年统计，胃癌病人术后5年的总体生存率低于25%〔7〕。

胃癌发生的分子基础是以癌基因的激活与抑癌基因的失活为基础的多步骤、多阶段效应过程，通过这些基因表达产物的改变，引起细胞恶性增殖、去分化和侵袭性生长，从而导致癌变过程。

从治疗策略看，控制癌基因的激活和抑癌基因的失活能够阻断肿瘤的发生。

自RNA干扰（RNAi）技术应用以来，其高效性、特异性和低毒性使得该技术在反向基因组学、基因治疗、抗肿瘤、抗病毒、抗遗传性疾病以及胚胎干细胞的研究中显示了巨大的潜力〔8，9〕。

　　Med19基因在酵母中又名ROX3（或SSN7、RMR1等），最初是在观察cyc7基因突变时发现的〔10〕，研究证实Med19编码产物属于中介体和RNA聚合酶Ⅱ全酶的亚基〔11〕。

Med19/Rox3构成了酵母RNA聚合酶Ⅱ的头部组件〔12，13〕。

缺失Med19/Rox3能够导致中介体中部组建的解离，仅保留由头部和尾部模块组成的亚复合体，提示Med19可稳定中部组件在中介体的位置，而对头部和尾部组件无影响。

此外，突变的Med19/Rox3中介体对RNA聚合酶Ⅱ的亲和力下降，无法刺激RNA聚合酶Ⅱ亚基羟基端结构域（Carboxyterminaldomain,CTD）的磷酸化〔14〕。

最近，Med19和Med26被确定为沉默转录因子RE1操纵的调控装置的重要组分〔15〕。

RE1沉默转录因子以Med19/Med26为桥梁招募中介体，以使非神经元细胞中的神经元特异性基因实现表观遗传沉默。

　　Med19在肿瘤中的研究还不完善，但关于Med19在胃癌组织中的表达问题已在本人的前期研究中得到证实和阐述，应用免疫组化组化方法检测Med19在胃癌、癌旁和正常组织中的表达，证实Med19在肿瘤组织中的高表达具有特异性，该基因的表达上调可能涉及胃癌癌变的发生。

但是Med19对细胞增殖和周期的影响尚未阐明。

我们在沉默Med19基因后，通过MTT法、克隆形成实验、流式细胞仪测定细胞周期以及Transwell实验观察细胞侵袭转移能力的变化，结果显示RNAi组与对照组相比，MGC803细胞的增殖能力显著降低，克隆形成能力减弱，细胞，细胞周期出现G1期阻滞，但对细胞的侵袭转移能力没有显著的影响。

本部分实验证实了利用RNAi技术抑制胃癌细胞Med19基因，能够有效地抑制胃癌细胞的恶性表征，提示在胃癌中靶向基因治疗中Med19可能成为有效的靶位点，具有良好的应用前景。

【参考文献】

　1KimYJ.AmultiproteinmediatoroftranscriptionalactivationanditsinteractionwiththeCterminalrepeatdomainofRNApolymeraseII〔J〕.Cell,1994;

77（4）:

599608.

　　2BjorklundS,GustafssonCM.TheyeastMediatorcomplexanditsregulation〔J〕.TrendsBiochemSci,2005;

30:

240.

　　3ChadickJZ，AsturiasFJ.StructureofeukaryoticMediatorcomplexes〔J〕.TrendsBiochemSci,2005;

30（5）:

26471.

　　4BoyerTG.MammalianSrb/MediatorcomplexistargetedbyadenovirusE1Aprotein〔J〕.Nature,1