基因操作与技术EGFP蛋白质的克隆表达Word文件下载.docx
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二、实验原理
EGFP简介:
EnhaneedGreenFluorescentProtein增强绿色荧光蛋白,EGFP是GFP突变系
目前应用较多的是GFP的突变体:
增强型绿色荧光蛋白(EGFP)(64位苯丙一亮),发射出的
荧光强度比GFP大6倍以上,因此,比GFP更适合作为一种报告基因来研究基因表达、调控细胞
分化及蛋白质在生物体内定位和转运等
绿色荧光蛋白(GreenFluorescentProtein,简称GFP)是一种在美国西北海岸所盛产的水母中所发现的一种蛋白质。
这类学名为Aequoreavictoria的水母有着美丽的外表,生存历史超过1.6亿年。
1962年,下村修正是在这种水母的发光器官内发现天然绿色荧光蛋白。
它之所以能够发光,是因在其包含238个氨基酸的序列
中,第65至67个氨基酸(丝氨酸一酪氨酸一甘氨酸)残基,可自发地形成一种荧光发色团。
发光机理
当蛋白质链折叠时,这段被深埋在蛋白质内部的氨基酸片段,得以亲密接触”导致经环化形成咪唑酮,并
发生脱水反应。
但此时还不能发射荧光,只有当有分子氧存在的条件下,发生氧化脱氢,方能导致绿色荧光蛋
白发色团的成熟”形成可发射荧光的形式。
上述绿色荧光蛋白发色团的形成过程,系由几位科学家分别研究
完成的。
绿色荧光蛋白分子绿色荧光蛋白不仅无毒,而且不需要借助其他辅酶,自身就能发光,可以让科学家
在分子水平上研究活细胞的动态过程。
当绿色荧光蛋白的基因和我们感兴趣的有机体内所拟研究的蛋白质基因相融合时,蛋白质既能保持其原有的活性,绿色荧光蛋白的发光能力也不受影响。
通过显微镜观察这种发光的标签”科学家就能做到对蛋白质的位置、运动、活性以及相互作用等一目了然。
在一个活体中有数万种不同的蛋白质,这些蛋白质精细地控制着重要的化学进程。
如果蛋白机制发生故障,通常就会发生疾病。
绿色荧光蛋白可帮助研究这类机制,这就是为什么绿色荧光蛋白成为生物科学极其重要的工具。
在它的帮助
下,科学家还能对各种细胞的命运了如指掌,比如,脑神经细胞是如何发育起来的,或者癌症细胞是如何扩散
的……
今天,已经有了许多新的不同的绿色荧光蛋白变体,这就进一步完善了绿色荧光蛋白作为基因标志在生
物研究中的广泛应用。
PEGFP-C1质粒
这次实验使用的模板是PEGFP-C1质粒,这是一种在哺乳动物细胞内高表达的质粒,从其图谱上可以看出其有三个起始位点,分别是SV40ori、pUCori、f1ori,分别是在哺乳动物细胞中复制的起始位点、在
E.coli中复制的起始位点和合成单链DNA的起始位点。
有三个启动子,分别是细菌Kan「抗性基因启动子
(在flori序列后面)、psv4o、pcMv(人类巨细胞病毒启动子),分别用于启动Kanr基因、Kanr/Neor抗性基因、EGFP。
因为pEGFP-C1中启动EGFP的启动子只在哺乳动物细胞中才能起作用,所以pEGFP-C1质粒
只能在E.coli中存在和复制,而不能表达EGFP。
pEGFP-C1质粒在E.coli中可以表达Kanr和Neor,可以
使用这两种抗生素进行质粒的筛选。
质粒上还有多克隆位点(MCS)、HSVTKpolyA、SV40polyA等序列。
表达载体pRSET
因为pEGFP-C1质粒在E.coli中只能存在和复制,而不能表达EGFP,所以将其EGFP序列转移到可
以表达的载体上进行表达。
pRSET载体含有相应的启动子,可以表达EGFP基因。
表达框架结构(以A为例说明位置):
T7启动子(20-39)6组氨酸(112-129)T7基因10前导序列(133-162)Xpress抗原位(169-192)MCS(202-248)T7反向引物(295-314)T7转录终止子(256-385)T7基因10前导序列(133-162):
提高蛋白质稳定性。
载体上有氨苄青霉素抗性基因,可以用来筛选。
pRSET有三种,分别是A、B、C,其序列稍有不同。
在克隆位点上进行双酶切时,上游用BamHI,下游
用EcoRI,为了使连接后的EGFP能有正确的阅读框并成功表达,需要选择正确的酶切位点和pRSET。
pRSETA、B、C的MCS差别:
pRSETA接第一位:
~AAGGATCGATGGG|GATCCGAG
pRSETB接第三位:
~AAG|GATCCGAGCTCGpRSETC接第二位:
~AAGGATCGATGIGATCCGABamHI切点:
GIGATCC
可以看出只有用pRSETA才能使连接上的下游序列从第一个碱基开始阅读,有正确的阅读框,所以选择pRSETA作为表达载体。
目的基因片段的PCR扩增
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引
物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:
①模板DNA的变性:
模板DNA经加热至93C左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,
为下轮反应作准备;
②模板DNA与引物的退火(复性):
模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55C左
右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;
③引物的延伸:
DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚
合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的半保留复制链”,而且
这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2〜4分钟,2〜3小时就能将待扩目的基因扩增放
大几百万倍。
到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
电泳鉴定分离纯化扩增片段
在pH值为8.0~8.3时,核酸分子碱基几乎不解离,磷酸全部解离,核酸分子带负电,在电泳时向正极移动。
采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物,在分子筛的作用下,使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异,从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。
核酸分子中嵌入荧光染料(如EB)后,在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。
核酸回收技术
琼脂糖中的DNA回收是用试剂盒法,先用BindingBufferB将切下来的含DNA片段的琼脂糖胶溶解,再离心,试剂盒的胶回收柱采用特殊的硅基质材料在一定的高盐缓冲系统下高效、专一的吸附DNA或RNA,最后再用洗脱液洗脱可以得到目的DNA片段。
目的基因和载体的限制性酶切
目的基因定向克隆到质粒载体,首先要将目的基因与载体经过特定的限制酶消化后,形成匹配末端。
虽然在基因克隆时,也可采用平末端方式连接,甚至是不匹配末端也可通过一定的处理进行连接,但匹配末端的连接是最有效的,而且连接效率要高于平末端的连接。
限制酶是能特异性结合并切割特殊DNA序列的核酸内切酶。
在基因工程中主要应用II类限制酶,因其能识别特异的DNA序列,并在识别位点内进行切割。
在进行限制性酶消化时,由于反应条件的变化容易产生星号活性,所以酶切反应要使用与酶配套的缓冲液,加入酶的量应控制在总体系的1/10之内,以防止甘油浓度过高.
序列分析后知道载体在表达框内有EcoRI和BamHI的唯一切点;
表达基因GFP的编码区内没有这二个酶的切点。
所以,可以用这二个酶将载体表达框切开、在对GFP编码框PCR扩增时两端增加这二个酶的识别位点将GFP的编码框插入表达载体。
从而使它得以表达。
双酶切时要选择合适的反应缓冲液,使两种酶的反应效率都达到较高的水平。
目的基因和载体片段的连接
限制酶切割后的目的基因片段和载体片段经回收纯化后,可以用连接酶进行连接。
连接酶能催化DNA片段3'
-OH和5'
-P反应,脱去水分子形成磷酸二酯键,把DNA片段连接起来。
进行匹配粘性末端的连接时,两种连接酶(DNA连接酶和T4DNA连接酶)都可以使用。
T4DNA连接酶是来自感染T4噬菌体的大肠杆菌,催化双链DNA平头末端或黏性末端相邻核酸的5'
-PO4和3'
-OH连接反应的酶,还可催化双链RNA和双链RNA或DNA连接,但不能催化单链核酸的连接。
可修补在双链DNA、RNA或DNA/RNA杂种分子中的单链切口。
反应需要ATP。
本酶催化ATP降
解为AMP和焦磷酸的反应,释放的能量使寡核苷酸5‘-P末端和3'
-OH末端结合;
也能催化分子内连
接的环化反应以及分子间的连接反应。
最小底物为NpNpNOH(3‘-OHOligomer,受体)、pNp(5'
、3‘-DPmonomer,供体)。
连接效率受供体和受体各自的碱基影响很大。
与RNA相比DNA连接的效率较低。
连接产物的转化
在体外组装的DNA重组分子只有转入合适的受体细胞,才能进行大量地复制、增殖和表达。
感受态:
易于接受外源DNA的生理状态(E.coli对数期)。
转入方式随载体的不同而不同,转移技术包括:
转化、转导、杂交、细胞融合及脂质体介导转移等。
质粒DNA导入细菌的过程为转化,主要有两种方法:
化学法转化和电击法。
化学法:
感受态细胞在0CCaCS低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基—钙磷酸复合物粘附于细胞表面;
42C时吸入DNA;
Ca2+和42C2min的处理能提
高转化效率。
大片段DNA(>50kb)不易转化。
感受态细胞转化完成后,将其涂布到含氨苄青霉素的平板上培养。
转化成功的细胞会有氨苄青霉素抗
性,从而可以正常生长。
有些细胞成功表达了EGFP,从而长出浅绿色的菌落;
有些细胞转化的载体可能
没有连接上目的基因片段,或者载体自连,虽然也能生长,但长出的是白色的菌落。
挑选培养基上的绿色单菌落在液体培养基中培养。
重组子的鉴定在实验室中,鉴定重组子最简单有效的方式是提取质粒,用限制酶消化检测是否有目的基因片段,并
辅助以PCR方法。
克隆如果成功的话,那么筛选出来的细胞内就有带有表达基因的质粒。
可以将它提取出来用相应的限制性内切酶切割得到对应长度的DNA片段。
同时,对于表达克隆,正确和成功的克隆会有表达的产物(GFP)。
对表达产物可以进行观察、分析验证。
鉴定出的重组质粒通常还用进行DNA序列的测定,确定插入的外源DNA片段是否为目的基因片段。
三、实验步骤:
一、PCR扩增EGFP,717bp引物AA+CC
成分
x1(ul)
X17(ul)
x19(ul)
X40(ul)
无菌dH2O
21.1
359
400.9
844
10xreactionbuffer
(无Mg++)
3
51
57
120
25MmMgCl2
1.8
31
34.2
72
DNTP(each2.5Mm)
1
17
19
40
10pmol/ul的引物
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