大鼠Rat血管内皮钙粘蛋白VE-cadherin-NEWA文档格式.doc
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3.细胞上清液:
3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4.组织匀浆:
将组织加入适量生理盐水捣碎。
3000转离心10分钟取上清。
5.保存:
如果样本收集后不及时检测,请按一次用量分装,冻存于-20℃,避免反复冻融,在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
自备物品
1.酶标仪(450nm)
2.高精度加样器及枪头:
0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3.37℃恒温箱
操作注意事项
1.试剂盒保存在2-8℃,使用前室温平衡20分钟。
从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶,这属于正常现象,水浴加热使结晶完全溶解后再使用。
2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中,密封(低温干燥)保存。
3.浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白;
按照说明书操作时样本已经稀释5倍,最终结果乘以5才是样本实际浓度。
4.严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
5.所有液体组分使用前充分摇匀。
试剂盒组成
名称
96孔配置
48孔配置
备注
微孔酶标板
12孔×
8条
4条
无
标准品
0.3mL*6管
样本稀释液
6mL
3mL
检测抗体-HRP
10mL
5mL
20×
洗涤缓冲液
25mL
15mL
按说明书进行稀释
底物A
底物B
终止液
封板膜
2张
说明书
1份
自封袋
1个
注:
标准品(S0-S5)浓度依次为:
0、0.5、1、2、4、8μg/mL
试剂的准备
20×
洗涤缓冲液的稀释:
蒸馏水按1:
20稀释,即1份的20×
洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。
洗板方法
1.手工洗板:
甩尽孔内液体,每孔加满洗涤液,静置1min后甩尽孔内液体,在吸水纸上拍干,如此洗板5次。
2.自动洗板机:
每孔注入洗液350μL,浸泡1min,洗板5次。
操作步骤
1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL;
3.样本孔先加待测样本10μL,再加样本稀释液40μL;
空白孔不加。
4.除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。
6.每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。
7.每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。
结果判断
绘制标准曲线:
在Excel工作表中,以标准品浓度作横坐标,对应OD值作纵坐标,绘制出标准品线性回归曲线,按曲线方程计算各样本浓度值。
试剂盒性能
1.准确性:
标准品线性回归与预期浓度相关系数R值,大于等于0.9900。
2.灵敏度:
最低检测浓度小于0.1μg/mL。
3.特异性:
不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
4.重复性:
板内、板间变异系数均小于15%。
5.贮藏:
2-8℃,避光防潮保存。
6.有效期:
6个月
免责声明
1.试剂盒仅供研究使用,不得用于临床实验或人体实验,否则所产生的一切后果,由实验者承担,本公司概不负责。
2.严格按照说明书操作,实验者违反说明书操作,后果由实验者承担。
FORRESEARCHUSEONLY.
NOTFORUSEINDIAGNOSTICPROCEDURES.
RatVE-cadherinELISAKitinstruction
Intendeduse
ThisVE-cadherinELISAkitisintendedLaboratoryforResearchuseonlyandisnotforuseindiagnosticortherapeuticprocedures.TheStopSolutionchangesthecolorfrombluetoyellowandtheintensityofthecolorismeasuredat450nmusingaspectrophotometer.InordertomeasuretheconcentrationofVE-cadherininthesample,thisVE-cadherinELISAKitincludesasetofcalibrationstandards.ThecalibrationstandardsareassayedatthesametimeasthesamplesandallowtheoperatortoproduceastandardcurveofOpticalDensityversusVE-cadherinconcentration.TheconcentrationofVE-cadherininthesamplesisthendeterminedbycomparingtheO.D.ofthesamplestothestandardcurve.
Samplecollectionandstorages
Serum-Useaserumseparatortubeandallowsamplestoclotfor30minutesbeforecentrifugationfor10minutesatapproximately3000×
g.Removeserumandassayimmediatelyoraliquotandstoresamplesat-20℃or-80℃.Avoidrepeatedfreeze-thawcycles
Plasma-CollectplasmausingEDTAorheparinasananticoagulant.Centrifugesamplesfor30minutesat3000×
gat2-8℃within30minutesofcollection.Storesamplesat-20℃or-80℃.Avoidrepeatedfreeze-thawcycles.
Cellculturesupernatesandotherbiologicalfluids-Removeparticulatesbycentrifugationandassayimmediatelyoraliquotandstoresamplesat-20℃or-80℃.Avoidrepeatedfreeze-thawcycles.
Note:
Thesamplesshoulebecentrifugateddequatelyandnohemolysisorgranulewasallowed.
Materialsrequiredbutnotsupplied
1.Standardmicroplatereader(450nm)
2.PrecisionpipettesandDisposablepipettetips.
3.37℃incubator
Precautions
1.Donotsubstitutereagentsfromonekittoanother.Standard,conjugateandmicroplatesarematchedforoptimalperformance.Useonlythereagentssuppliedbymanufacturer.
2.Donotremovemicroplatefromthestoragebaguntilneeded.Unusedstripsshouldbestoredat2-8°
Cintheirpouchwiththedesiccantprovided.
3.Mixallreagentsbeforeusing.
Removeallkitreagentsfromrefrigeratorandallowthemtoreachroomtemperature(20-25°
C)
Materialssupplied
Name
96determinations
48determinations
Microelisastripplate
12*8strips
12*4strips
Standard
0.3ml*6tubes
SampleDiluent
6.0ml
3.0ml
HRP-Conjugatereagent
10.0ml
5.0ml
20XWashsolution
25ml
15ml
ChromogenSolutionA
ChromogenSolutionB
StopSolution
Closureplatemembrane
2
Usermanual
1
Sealedbags
Standard(S0→S5)concentrationwasfollowedby:
0,0.5,1,2,4,8μg/ml
Reagentpreparation
washsolution:
DilutewithDistilledordeionizedwater1:
20.
Assayprocedure
1.Prepareallreagentsbeforestartingassayprocedure.ItisrecommendedthatallStandardsandSamplesbeaddedinduplicatetotheMicroelisaStrippl
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