椎间盘细胞组织工程的研究进展Word下载.docx
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(2)在体外扩增达到所要求的细胞数量时能维持原有的表型;
(3)适应性强,植入机体后具备较强的传代繁殖能力。
自体椎间盘细胞
目前国内外进行自体椎间盘细胞的单层培养或三维培养的实验研究很多,技术方法较成熟,相关报道亦较多。
2001年Sun等〔1〕报道利用体外培养绵羊腰椎间盘髓核细胞,通过组织工程技术获得具有一定形态结构和相似成分含量的腰椎间盘髓核组织。
Gruber〔2〕研究发现单层培养基中纤维环细胞形态为扁平形和梭形,免疫组化显示少量Ⅰ、Ⅱ型胶原形成:
在血小板衍生生长因子(PDGF)作用下单层培养细胞有丝分裂能力较强。
Sato等〔3〕研究结果表明,单层培养条件下内层纤维环细胞基质中糖胺聚糖含量高于外层。
内层纤维环细胞呈多角形,有丰富的细胞外基质,而外层纤维环细胞呈纺锤形,细胞外基质稀少。
Gancey等〔4〕将狗自体髓核细胞体外培养,通过经皮穿刺途径重新植入标记后的同一实验对象椎间盘内,3、6、9、12个月后进行MRI、X线和组织学评价,亦发现自体髓核细胞植入有助于减缓椎间盘退变。
Mizuno等〔5〕从羊腰椎间盘获取纤维环及髓核,分别进行分离,消化,细胞培养3周,纤维环支架通过聚乙醇酸和聚乳酸构建,髓核细胞与2%的藻酸盐液混合后,注入到纤维环的中央,将复合体移植到裸鼠皮下,分别在4、8、12周时采集细胞进行胶原定型及蛋白多糖、羟基脯氨酸和DNA分析,结果显示,在人体标本及组织学方面,组织工程化椎间盘与正常椎间盘十分相似,并在12周时仍然类同于正常椎间盘组织,同时组织工程化椎间盘纤维环富含Ⅰ型胶原,髓核富含Ⅱ型胶原,亦与正常椎间盘组织相似。
同种异体及异种椎间盘细胞
Nomura等〔6〕植入同种异体完整的兔髓核或有活性的髓核细胞,16周后的结果显示,接受完整髓核的椎间盘退变最轻,未治疗的对照组退变最重,各组均无免疫排斥反应出现。
提示虽效果不同,但同种异体髓核移植及单纯细胞移植均可抑制椎间盘退变。
Kusior等〔7〕从小牛的髓核组织中分离细胞,单层培养约2周后分别接种在3种不同的聚合物(聚乙醇酸、藻酸钙、聚醚)上,而后植入裸鼠皮下,1、3、5、10周后获取标本,与对照组相比,聚合物上长出大量的类髓核组织。
Sato等〔8〕将从日本兔椎间盘中分离出的纤维环细胞用PKH-26荧光染色标记后种植于蜂窝状胶原基质支架内,培养1周后移植于髓核被激光汽化的白兔的椎间盘内,分别于术后2、4、8、12周通过X线片观察椎间盘高度丢失情况并取椎间盘标本,通过标本连续冰冻切片评估荧光染色后的髓核细胞的增殖能力,同时将标本番红染色后进行组织学评定,研究发现同种异体移植细胞能在受体的椎间盘内存活,并具有透明软骨样的细胞增殖能力,能够有效预防椎间盘高度的丢失。
间充质干细胞(MSCs)
MSCs是具有自我更新能力且在适宜微环境下具有多向分化潜能的原始细胞,具体向何方向分化是由周围微环境调控的。
在培养基中加入一定的诱导剂可以诱导MSCs向一定方向分化。
MSCs可通过患者自体骨髓穿刺获取,操作容易,并发症少,可避免产生免疫排斥反应。
来于自体,无需配型,无抗原性,是组织工程中重要的种子细胞之一〔8〕。
来源于骨髓、脂肪组织的间充质干细胞可通过体外培养大量扩增,并能在成软骨或成纤维组织培养条件下诱导分化为成软骨细胞或成纤维细胞。
Zuk等〔10〕从人体抽吸的脂肪组织中分离培养出成纤维样细胞,此细胞能在体外稳定扩增。
使用免疫荧光和流式细胞仪分析发现,这些细胞大部分来源于中胚层或间充质,在一定条件下,可以向脂肪细胞、软骨细胞、肌肉细胞和成骨细胞分化。
Sakai等〔11〕将兔自体间充质干细胞植入胶原凝胶支架,培养后再植入兔髓核中,结果显示其可减缓椎间盘退变,增强了MSCs实际应用于椎间盘退变治疗的可能性。
鞠小东等〔12〕取2周龄Lewis大鼠的腹股沟脂肪垫,消化法获得脂肪MSCs,用成骨诱导培养基诱导其向成骨细胞方向分化,并通过组织化学、免疫细胞化学等方法检测细胞分化情况,结果显示从成体大鼠脂肪组织中培养出的脂肪MSCs能大量稳定增殖传代,经诱导后可分化为脂肪细胞和成骨细胞。
这些研究成果为寻求组织工程化椎间盘的种子细胞新来源奠定了一定的基础。
2椎间盘组织工程细胞培养
健康的椎间盘基质主要有胶原和蛋白多糖组成。
大分子的蛋白聚糖分子通过聚糖蛋白单体分子与连接蛋白和硫酸软骨素相互作用聚集形成,并与胶原纤维相互作用组成有序的基质结构,对抗张力和压力。
椎间盘最多的糖胺多糖为硫酸软骨素和硫酸角质素,前者在正常椎间盘占多数,而后者在退变椎间盘中占优。
不同椎间盘细胞培养方法对细胞外基质的产生能力和维持细胞表型有所不同,细胞的形态与细胞外基质形成及增殖密切相关
椎间盘细胞的单层培养
1991年Ichimura等〔13〕和1998年Shinmei等〔14〕进行了椎间盘细胞的单层培养。
观察影响细胞培养的因素,检测蛋白多糖、胶原和DNA的合成。
1999年刘勇等〔15〕也成功地进行了胎儿椎间盘细胞的单层培养。
目前,国内外进行椎间盘细胞单层培养的实验研究较多,技术方法已经成熟。
椎间盘细胞的三维培养
静止性三维细胞培养
由于重力作用,静止培养时细胞多聚集到载体的底部和载体之外,载体内部黏附生长的细胞数量很少,导致载体内部移植细胞数量的不足。
Holy等〔16〕的研究发现,静止性三维细胞培养对载体内部的最大细胞量占最初种植细胞量的25%,其余75%的细胞均在载体的底部。
载体中细胞的数量对体外和体内椎间盘组织的形成起关键的作用。
静止细胞培养方法限制了载体内部细胞的数量,从而会影响椎间盘组织的形成。
除了细胞数量的限制外,还限制了细胞生长的深度。
因此,需要改善培养条件或细胞种植方法来解决细胞数量不足和分布不均匀的问题。
动力性三维细胞培养
现在许多动力性三维细胞培养的研究是在应用旋转生物反应器(RCCS)模拟微重力的条件下进行的。
Botchwey等〔17〕在生物反应器中培养了成骨性细胞,与静止细胞培养比较发现,可以保持成骨性细胞显型,并且可增加细胞碱性磷酸酶表达和基质矿化。
Oiu等〔18〕在微载体上培养鼠骨髓基质细胞,探讨了模拟微重力下骨相关性生化标志物的表达,并计算液体流动在载体表面所产生的不同剪切力的大小。
应用生物反应器悬浮培养方式,能够产生层流以减少使细胞发生聚集的机械应力,其流体动力性和自由的三维空间,易于氧气扩散,可利用力学的培养条件保持培养细胞的特性。
动力性三维细胞培养有许多静止细胞培养所不具备的优点:
(1)在三维载体中,能够产生有效的、均匀的细胞种植,允许移植最大数量的细胞;
(2)能够促进氧气和营养物质向载体内部输送,保持载体内部细胞的活性和功能的发挥;
(3)能够促进载体中黏附生长细胞的增殖,分泌更多细胞外基质,促进椎间盘细胞再生;
(4)椎间盘细胞能够沿着三维载体的孔隙生长;
(5)能够排出更多的CO2,维持生理性pH值,为细胞代谢和功能发挥提供更有利的微环境;
(6)培养液流动能够对细胞产生机械应力刺激,调节成纤维性细胞功能的发挥。
目前,还没有用做重力旋转培养系统培养椎间盘细胞的报道,这可能是今后进行椎间盘细胞实验研究的一个重要方向。
椎间盘组织工程三维细胞培养的载体材料
载体支架材料的基本功能
生物载体材料在椎间盘组织工程中起着替代细胞外基质或组织、器官基质的作用。
其主要功能包括以下两点:
(1)为组织或器官体外构建工程提供三维的细胞生长支架,使细胞间形成适宜的空间分布和细胞联系;
(2)提供特殊的生长和分化信号,维持细胞的定向分化。
载体支架材料的特性
(1)良好的组织相容性。
(2)良好的生物可降解性。
(3)良好的细胞界面。
(4)三维立体多孔结构。
(5)可塑性和一定的机械强度。
载体支架材料的种类
细胞种植载体包括天然和人工合成两种基质材料。
以前应用海藻酸钙进行椎间盘细胞三维培养的研究居多,现在多应用高分子聚合材料来做椎间盘组织工程支架。
3椎间盘组织工程中的相关生长因子
近年来很多学者研究发现,某些细胞生长因子在椎间盘生长发育和再生修复过程中发挥着十分重要的作用。
转化生长因子-β(TGF-β)
TGF-β是一族广泛存在并具有多种功能的多肽生长因子,具有调节细胞生长、分化、凋亡和细胞外基质(ECM)合成的功能。
陈岩等〔19〕观察了不同浓度的TGF-β1对纤维环及髓核细胞Ⅰ型胶原mRNA的调节作用。
发现TGF-β1可发挥剂量依赖性的正向调节作用,此调节作用在传代细胞更为明显,提示TGF-β与退变椎间盘中Ⅰ型胶原的不断增多有密切关系。
骨形态发生蛋白(BMP)是TGF-β的超家族成员之一,BMP-7(OP-1)是BMP家族中的一员,能促进软骨细胞合成Ⅰ型胶原和蛋白多糖。
Takegami等〔20〕观察到IL-1培养条件下髓核细胞、纤维环细胞基质小蛋白多糖和胶原含量降低,加入OP-1后髓核细胞、纤维环细胞恢复了蛋白多糖含量,而且弹性分子多于没加IL-1的细胞。
胰岛素样生长因子(IGFs)和血小板衍生生长因子(PDGF)
IGFs是—种低分子量多肽,具有胰岛素样作用。
体外培养条件下具有维持细胞表型、促进细胞外基质合成、抑制细胞凋亡和促进细胞增殖作用。
有学者认为年龄大者椎间盘细胞数目少的主要原因是细胞的凋亡。
Osada等〔21〕研究则发现暴露于IGF-1中,在体外培养出的胎牛髓核细胞多于成年牛髓核细胞,IGF-1能刺激体外培养髓核细胞的增殖及蛋白多糖的合成。
也有学者发现IGF-1可能通过调整金属蛋白酶(MMP)和金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)来影响细胞外基质,能降低MMP-2活性。
IGF-1和刀豆球蛋白A联合刺激培养细胞,能恢复MMP-2活性。
Gruber等〔22〕研究发现在1%血清培养液中培养纤维环细胞,引起明显凋亡,而暴露于IGF-1(50~500ng/ml)或PDGF(100ng/ml)的1%血清培养液中,椎间盘细胞凋亡的比例明显减少。
体外培养椎间盘细胞中IGF-1和PDGF具有明显的抗细胞凋亡作用,PDGF对体外培养细胞有明显促分裂作用。
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及表皮生长因子(EGF)
目前对bFGF和EGF的研究相对较少,并且主要集中于在退变椎间盘中的作用。
退变的椎间盘细胞因缺乏FGF和EGF及其受体,可以导致细胞外基质成分的丢失。
FGF又可分为碱性和酸性成纤维细胞生长因子(bFGF和aFGF),它们作用于共同的受体并具有高度结构同源性(55%),通过自分泌和旁分泌的方式与其两种受体结合,对来源于中胚层和神经外胚层的多种细胞,如:
成纤维细胞、血管内皮细胞、软骨细胞等均具有促进生长、增殖、分化的作用。
Nagano等〔23研究发现bFGF可以通过自分泌或旁分泌的形式促进大鼠退变椎间盘内软骨细胞的增生。
总之,椎间盘组织含有多种细胞因子,共同作用于椎间盘细胞的分裂、生长、成熟、凋亡各阶段。
通过对各种细胞因子对体外培养椎间盘细胞作用的研究,希望找到合适的因子来阻止、甚至逆转椎间盘退变过程。
4应力对椎间盘细胞外基质表达的影响
椎间盘是由凝胶状的髓核和几层同心排列的纤维轴环构成。
当椎盘承受外负荷时,髓核静水压升高,向各方向均匀作用,使纤维环承受张应力。
然而,不同椎间盘细胞对不同力学刺激反应差
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