胰腺癌发病中NFκB与Hedgehog信号通路交互作用的Kras基因突变依赖性的分子机制研究Word格式文档下载.docx
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结果显示,瞬转/稳转Gill质粒的SWl990细胞cpNF—KB基因mRNA及核内蛋白表达较对照组细胞明显升高。
此结果证明,Gill过表达,HH通路活化可在K—ras
突变细胞巾促进NF—KB活化。
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图3-4GliI转染对NF.KB基因表达的彩响。
G川eDNA质粒瞬转和稳转细胞后·
SWl990
NF-KB基因mRNA和核蛋白表达均增高(c)。
,P<
00l
4、Gill过表达对细胞增殖的影响
利用CCK.8试剂盒检测细胞增殖能力,分别检测0h、12h、24h、36h释I48h
时450nm下OD值。
36h对照组OD值:
172±
005,Glil稳转组OD值:
l88±
017(P<
005),Glil瞬转组OD值:
200±
029(P<
001)。
48h对照组OD值:
207±
016,Glil稳转组OD值:
238±
003(P<
005),Glil瞬转组OD值:
296±
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结果显示,和对照组相比,Glil过表达细胞于细胞生长36h及4811表现出统计学差异。
另外,在48h时瞬转Glil组和稳转Glil组间表现出统计学差异(P(o01)(图3-5),这一结果町能和瞬转组拥有更高的Glil表达水平相关。
上述结果证明,在K.ras突变细胞中,Glil过表达,HH通路活化町促进细胞增殖
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图3-5Gill过表达对细胞行为学的影响。
和对照组相比,两种Glil过表达细胞于牛长36h起增殖显著增快,且在48h时瞬转Glil组和稳转Olil组问表现出统计学差异。
5、Glil过表达对抑制细胞凋亡的影响细胞培养48h后,利用流式细胞仪检测细胞凋亡。
对照组凋亡细胞百分比为:
1633±
097%,Glil稳转组凋亡细胞百分比为:
11.06±
074%(P(001),Glil瞬转组凋亡细胞百分比为:
1106-±
074%f尸(0011(图
3—6)。
结果证明,在K—las突变PDAC细胞中,Glil过表达,HH通路活化可显著抑制细胞凋亡
星:
鲎
圈3-6Glil过表达对细胞行为学的影响。
和对j!
l【组相比,Hill过表达细胞有效抑制细胞凋亡
6、Glil过表达对细胞迁移、侵袭的影响
(I)利用划痕实验检测细胞迁移能力
分别在划痕后0h和24h记录,将24h的划痕面积和对应细胞0h的划痕面积相比较,判断细胞迁移能力。
和初始面积比对照组:
0.73±
005,Gill稳转组:
0.61±
005(P<
005),Glil瞬转
g_-军医大学博士学位论文
组:
0.32±
009(P<
005)。
(图3—7)。
和对照组SWl990细胞相比,Glil过表达在K—ms突变PDAC细胞中,促进了细胞迁移,但仅有Gill瞬转细胞的促进作用有统计学意义。
结果提示,Glil过表达可促进细胞迁移。
(2)利用transwell小室对细胞迁移、侵袭能力进行检测
分别于24h(迁移)和60h(侵袭)时记录细胞数量(高倍镜下选取6个视野计数,后计算与对照组细胞数目的比值)。
对照组:
101±
013,Glil稳转组:
143±
010
(肚005),Glil瞬转组;
361±
052(P<
000。
Gill过表达可促进细胞侵袭,对照组:
100士O21,Glil稳转组:
149±
018(尸<
005),Gill瞬转组:
4.60±
05l(尸<
(图
3—7)。
结果表明,和对照组SWl990细胞相比,Glil过表达可促进细胞迁移、侵袭。
移、侵袭能力,m”
研究证明,Glil过表达,HH通路活化在K.ras突变PDAC细胞中,可促进细胞迁
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圈3·
7Glil过表达对细胞行为学的影响。
和对照组相%,GIil过表逃日性班细腮j±
榜t但仪有Glil瞬转细胞的促进作用有统计学意义;
两种Glil过表达可促进细胞迁移、侵袭。
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(二)利用Shh刺激不同K-ras表型PDAC细胞,观察HH通路
以及其对NF.KB活化的作用1、Shh刺激对Shh、Gnl和NF.KB表达的影响
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(1)Shh刺激对Shh、Glil和NF_KBmRNA和蛋白表达的影响
用100ng/mlShh分别刺激K-ms突变型的SWl990、Panc一1细胞和K—Fas野生型BxPC-3细胞,(单纯培养液处理作为对照组)刺激48h后收集细胞,分别利用
q-PCR
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图3.83株不同K-ras表型的变
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图3-103株不同K-ras表型的PDAC细胞株分别被Shh刺激后Shh的mRNA表达变化。
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图3-】l3株不同K—ras表型的PDAC细胞株(SWl990,G13D突变、Pane.1,G12D突变和BxPC-3,野生)分别被Shh刺激后№浆Shh蛋白,Gill利NF.KB核蛋白表达变化。
第二军医大学博士学位论文
和westernblot检测Glil、NF—KB和Shh的mRNA和蛋白表达变化,判断不同K。
ras表型的细胞中,Shh对HH通路的活化作用,以及HH通路对NF.KB的活化作用。
SWl990中,对照组Glil的mRNA相对表达量:
1.03+0.18;
Shh刺激后Glil的mRNA:
26.87+6.11(P<
0.01)。
对照组NF.KB的mRNA:
1.01土0.19;
Shh刺激后NF—KB的mRNA:
6.27士1.00(尸<
对照组Shh的mRNA:
1.0010.10;
Shh刺激后Shh的mRNA:
6.08士0.25(P<
Panc.1中,对照组Glil的mRNA:
1.04士0.29;
Shh刺激后Glil的mRNA:
14.93土0.88(P<
对照组NF—v.B的mRNA;
1.03士0.15;
Shh刺激后NF.KB的mRNA:
5.57士0.78(P<
1.01士0.05;
Shh刺激后Shh的mRNA:
5.72+0.17(尸<
BxPC.3中,对照组Glil的mRNA:
1.01士0.22;
0.93士0.20(尸>
O.05)。
对照组NF.KB的mRNA-1.02土0.14;
Shh刺激后NF.KB的
mRNA:
0.94士0.10(胗O.05)。
1.0210.08;
Shh刺激后Shh
的mRNA:
1.03士0.11(胗0.05)。
(图3—8~图3一l1)。
实验发现,在K—ras突变型的SWl990、Panc.1细胞中,Shh刺激可以增加Glil的表达,活化HH通路,并且,HH通路的活化可导致NF—KB的活化。
但在K—ras野生的BxPC一3中则未观察到上述改变。
研究提示Shh刺激导致HH通路经典活化过程,以及其对NF.KB的活化作用存在K.ras突变依赖。
同时,K.ras突变细胞中Shh的表达也增加,可能与NF.KB通路活化后,促进Shh表达上调,进而正反馈活化HH通路相关。
该结果再次提示,HH通路和NF.KB通路问存在正反馈作用,而此作用也存在K.ras突变依赖性。
(2)Shh刺激对Glil启动子活性的表达的影响利用双荧光素酶实验,检测Shh刺激后,Glil启动子活性的变化(图3.12)。
SWl990中,pRL.TK(海肾荧光)和pGL3.8×
GlilBS(野生,萤火虫荧光)
共转染后,对照组萤火虫荧光/海肾荧光:
0.67+0.05;
Shh刺激后萤火虫荧光/海肾荧光:
1.26土0.04(P<
pRL.TK和pGL3.8×
GlilBS突变质粒共转染作为阴性对照,对照组萤火虫荧光/海。
肾荧光:
0.66士0.00,Shh刺激后萤火虫荧光/海肾荧光:
0.82+0.26f尸>
0.05)。
Panc.1中,pRL—TK和pGL3.8xGlilBs共转染后,对照组萤火虫荧光/海肾荧光:
1.8土0.25;
Shh刺激后萤火虫荧光/海肾荧光:
6.27土0.57(P<
pRL—TK和pGL3.8×
GlilBs突变质粒共转染的对照组萤火虫荧
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