农药分析与检测实验指导Word下载.docx

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费休试剂的主要成分为I2、SO2、C5H5N和CH3OH，应用时试剂各成分理论摩尔比为I2:

SO2:

C5H5N:

CH3OH＝1:

1:

3:

1。

这种试剂有效浓度取决于碘的浓度。

新配制的试剂其有效浓度不断降低，其原因是由于试剂中各组分本身也含有一些水分，但试剂浓度降低的主要原因是由一些副反应引起的，较高消耗了一部分碘。

这也说明了配制这种试剂要单独配，分甲乙两种试剂并且分别贮存，临用时再混合，而且要标定。

四、操作步骤

1、配制卡尔·

费休试剂

称85gI2→于干燥的有塞棕色烧瓶中→加670mL无水CH3OH→塞上瓶塞→振摇使I2全部溶解→加270mL吡啶→混匀→于冰水浴冷却→通干燥的SO2气体60g→塞上瓶塞→于暗处24h后标定使用。

2、滴定操作

先加50mL无水甲醇→于反应器中→接通电源→启动电磁搅拌器→用KF试剂滴入甲醇中使甲醇中尚残留的痕量水分与试剂达到终点（即指针到达一定刻度，不记录KF试剂用量）→保持1min→用10μL注射器从反应器加料口注入10μL蒸馏水（相当于0.01g水）→电流表指针接近零点→用KF试剂滴定到原定终点→记录。

　　F=G*100/V

　　F表求KF试剂的水当量（mg/ml）

　　V表示KF滴定消耗试剂的体积（ml）

　　G表示样品中的水的重量（g）

实验二乳液稳定性测定

（GB/T1603--2001）

一、实验目的

学习并掌握农药乳液稳定性的国标测定方法

乳液是一种液体以细小液珠形式分散在另一种与它不相混溶的液体中形成的体系（其中一相为水相，另一相为有机相）。

该体系为热力学不稳定体系，它会自动絮结而使体系分为油、水两相，为了充分发挥农药产品药效的目的，就必须要求农药产品使用时是均匀地分散于水中的。

因此在农药剂型加工过程中，往往需要加入乳化剂以阻止油相的重新絮结，以提高制剂的稳定性。

将样品用标准硬水按各种产品规定的稀释度配成乳状液，静置一定时间后，取出观察乳液的分离情况来衡量乳液的稳定性能。

三、所需仪器和药品

1、试剂和溶液

无水氯化钙和碳酸钙（使用前在400℃下烘2h）；

盐酸；

标准硬水：

硬度以碳酸钙计为0.342g/L。

2、仪器

量筒（容量100mL，内径28±

2mm，高250±

5mm）；

烧杯（250mL，直径60-65mm）；

玻璃搅拌棒（直径6-8mm）；

移液管（刻度精确至0.02mL）；

恒温水浴。

在250mL烧杯中，加入10mL30±

2℃标准硬水，用移液管吸取适量乳剂试样，在不断搅拌的情况下慢慢加入硬水中（按各产品规定的稀释浓度），使其配成100mL乳状液。

加完乳剂后，继续用2-3r/s的速度搅拌30s，立即将乳状液移到清洁、干燥的100mL量筒中，并将量筒置于恒温水浴内，在30±

2℃范围内，静置1h，取出，观察乳状液分离情况，如在量筒中无浮油（膏）、沉油和沉淀析出，则判定乳液稳定性合格。

实验三薄层色谱法

掌握薄层色谱法分离和鉴定有机物（农药）的原理和操作步骤。

薄层色谱法是把吸附剂（薄层层析硅胶G、薄层层析硅胶GF254）均匀地铺在板基上（玻璃板、陶瓷）上，将等分离农药样品滴加在薄层一端，当展开剂（流动相）沿着含有固定相的板基（薄层板）向上移动时，被分离组分在固定相和流动相间进行分配或吸附，经过反复多次的分配平衡或吸附平衡，最后按各个组分的差异而被分离。

仪器：

电子天平、三用紫外分析仪、电热恒温培养箱、玻璃板、量筒、层析缸、烧杯、尺子。

药品：

乐果、氧化乐果、碘、显色剂、薄层层析硅胶G、薄层层析硅胶GF254（荧光）、羧甲基纤维素钠、

1、制板

板基规格：

15×

15cm，要求所铺薄层厚度约为0.5-0.25mm，因硅胶的粘附性差，往往需要加入粘合剂。

硅胶G、即CaSO4∙1/2H2O，一般可直接应用，但为了使吸附剂与板基较牢固地结合，本次实验又加入了CMC-Na（羧甲基纤维素钠）作为加强吸附剂。

每板干的硅胶G22g+1%CMC-Na水溶液60mL充分混合铺板，并振荡使其在板基上形成均匀的薄层，铺好后放在水平的桌面上静置，使其固化晾干，再放入110℃的烘箱中活化1小时，之后自然冷却，放入干燥器中保存。

2、点样

在制好的板基上一端约1.5cm处轻轻地用铅笔划出点样线，用流量点样器，在点样线上点样点，直径3-5mm，（点样量大约10-20mL），在定性和定量时，同一薄层上样点直径、位置就基本一致。

3、展开

先用展开的溶液剂对展析缸进行蒸汽饱和5-10min，加入适量的展开剂（液面高度1cm），切记不能浸没点样线！

然后把点过样的薄层板，放入层析缸，密封层析缸，展开，该过程中注意观察溶剂前沿应到达板上端约1cm处停止展开，不准超过薄层板。

4、显色

取出展开好的薄层板后，用电吹风吹干溶剂进行显色，若农药本身在紫外光下无色色反应，要进行显色处理，若用的是荧光板，可直接观察（板有荧光，但农药无荧光）。

显色剂：

（1）溴酚蓝2g+200mL无水乙醇

（2）柠檬酸钠10g+200mL丙酮

5、计算比移值

Rf=组分迁移距离（cm）/溶剂前沿离开点样线的距离（cm）

实验四农药残留分析样本样本制备——匀浆提取法

1、掌握添加回收率实验方法及操作；

2、学习并掌握洋白菜（甘蓝、结球甘蓝）中几中杀虫剂残留分析样本的制备。

蔬菜样本匀浆后，按MRL、LCL（最低检测浓度）剂量添加待测农药混匀后适当的提取溶剂，震荡，根据分配原理，使农药转相，即被分配到提取溶剂中，经离心，取上清液、浓缩、样品上机分析。

低温冷冻离心、天子天平、组织捣碎机、旋转蒸发仪等；

四种标品农药：

双氧威、甲萘威、毒列蜱、虫酰肼；

重蒸丙酮、乙酸乙酯等。

1、分析待测样品和农药特性，确定提取溶剂；

2、对残留蔬菜匀浆；

3、按设计添加浓度和剂量添加待测药液；

4、震荡提取20min；

5、离心4000r/min，10min沉隆杂质；

6、取上清液

7、上清液浓缩后，用针头过滤器0.22μm过滤，用氮吹仪吹至近干（低于0.5mL），定容到1mL待测。

实验分组：

第一组：

毒死蜱MRL0.1mg/kg引用标准：

GB/T8321

500ppm1mg/kg（加10μL）0.1mg/kg（加1μL）

第二组：

甲萘威MRL2.5mg/kg引用标准：

1250ppm2.5mg/kg（加10μL）0.25mg/kg（加1μL）

第三组：

双氧威MRL0.1mg/kg引用标准：

2006年5月29日实施“食品中残留农用化学品肯定列表制度”500ppm1mg/kg（加10μL）0.1mg/kg（加1ul）

第四组：

虫酰肼MRL2mg/kg引用标准：

500ppm2mg/kg（加20μL）0.2mg/kg（加2μL）

第五组：

只加5mL提取液，作基质空白

第六组：

溶剂空白（作色谱的时候需要看一下溶剂的纯度）

四个班共做4次重复。

实验五农药残留样品分析——GC/NPD外标法

通过实验，巩固和验证课堂所学有关GC/NPD外标法对残留样本中残留农药定量分析，掌握GC外标法操作方法。

在一定的色谱条件下，制备的残留分析样品在GC/NPD的响应值与样品进样量间呈正比例关系。

通过未知含量样品进行获得的色谱峰积分面积代入所建立的外部标准品标准曲线，即可求得其含量。

三、实验步骤

1、建立外标物的标准曲线；

2、未知含量样品；

3、优化未知含量样品的色谱峰（命名、设置面积门槛值、积分等）；

4、获取谱图的校正信息；

5、建立色谱分析报告模板；

6、输出检测信息。

试验六间接ELISA检测抗体效价

通过实验，巩固和验证课堂所学有关酶免疫检测理论与技术，掌握间接ELISA操作方法。

本实验依据抗原抗体的特异性、可逆性反应为基本原理进行设计，在聚苯乙烯板（酶标板）上包被人工抗原（OVA-Hapten，2ug/mL），包被抗原与药物半抗原的抗体（Ab）进行反应，加入酶标二抗（RaMIgG-HRP）后，用四甲基联苯胺（TMB）底物显色，Ab效价越高，显色越深，吸收值（A450）越大；

效价越低，显色越浅，A450越小，以此来检测血清中的抗体效价。

三、实验材料

（一）药品试剂

1、包被抗原OVA-CL；

2、Aｇ；

3、封闭液５％猪阴性血清＋95%PBST；

4、RaMIgG-HRP；

5、3、4号酶底物溶液6、终止液

（二）仪器设备

１、微量加样器：

15把2、酶标板：

每４人1组，每组８条，每条12孔。

（三）实验分组４人/组。

1、包被

（1）包被抗原OVA-CL：

方阵滴定法选择工作浓度（教师做），包被浓度为２ug/孔；

（2）包被稀释液（CBS）的配制：

1.59gNaC03+2.94gNaHC03+1L双蒸水即可；

（3）加样：

100uL/孔；

（4）温育：

37℃,2h；

（5）洗板：

用PBST洗板3次，每次间隔3min。

2、封闭

（1）封闭液的配制：

95％PBST+5％猪阴性血清；

（2）加样：

250uL/孔；

（3）温育：

37℃；

（4）洗板：

3、加一抗

（1）铺底：

先用封闭液铺底，每孔50uL，12孔全加；

（2）加一抗血清50Ul/孔，倍比稀释至第10孔，第11孔加1∶500鼠阴性血清50Ul，第12孔不加作为空白对照；

之后倍比稀释至第10孔，血清稀释倍数如下：

孔数

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

封闭液铺底（uL）

50

ＣＬｍＡｂ效价

2500

5000

1×

104

观察结果

37℃，15min；

4、加酶标二抗

（1）酶标二抗的制备及工作浓度的标定：

酶标二抗RaMIgG-HRP（辣根过氧化物酶Horseradishperioxidase，HRP），工作浓度为1∶1000；

（2）稀释：

用封闭液将酶作1'

500稀释；

50ul／孔，温育37℃，25min；

用PBS