蛋白质的一级结构共价结构Word下载.docx
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(8)确定肽段在多肽链中的顺序。
(9)确定多肽链中二硫键的位置。
蛋白质测序的基本策略
对于一个纯蛋白质,理想方法是从N端直接测至C端,但目前只能测60个N端氨基酸。
直接法(测蛋白质的序列)
两种以上特异性裂解法
NC
A法裂解A1A2A3A4
B法裂解B1B2B3B4
用两种不同的裂解方法,产生两组切点不同的肽段,分离纯化每一个肽段,分离测定两个肽段的氨基酸序列,拼接成一条完整的肽链。
间接法(测核酸序列推断氨基酸序列)
核酸测序,一次可测600-800bp
测序前的准备工作
蛋白质的纯度鉴定
纯度要求,97%以上,且均一,纯度鉴定方法。
(两种以上才可靠)
⑴聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带
⑵DNS—cl(二甲氨基萘磺酰氯)法测N端氨基酸
测定分子量
用于估算氨基酸残基n=
方法:
凝胶过滤法、沉降系数法
确定亚基种类及数目
多亚基蛋白的亚基间有两种结合方式:
⑴非共价键结合
8mol/L尿素,SDSSDS-PAGE测分子量
⑵二硫键结合
过甲酸氧化:
—S—S—+HCOOOH→SO3H
β巯基乙醇还原:
举例:
:
血红蛋白(α2β2)
(注意,人的血红蛋白α和β的N端相同。
)
分子量:
M
拆亚基:
M1、M2两条带
拆二硫键:
分子量关系:
M=2M1+2M2
测定氨基酸组成
主要是酸水解,同时辅以碱水解。
氨基酸分析仪自动进行。
确定肽链中各种a.a出现的频率,便于选择裂解方法及试剂。
①Trp测定
对二甲基氨基苯甲醛590nm。
②Cys测定
5、5/一二硫代双(—2—硝基苯甲酸)DTNB,412nm
端基分析
①N端分析
DNS-cl法:
最常用,黄色荧光,灵敏度极高,DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。
DNFB法:
Sanger试剂,DNP-多肽,酸水解,黄色DNP-氨基酸,有机溶剂(乙酸乙酯)抽提分离,纸层析、薄层层析、液相等
PITC法:
Edman法,逐步切下。
无色PTH-氨基酸,有机溶剂抽提,层析。
②C端分析
A.肼解法
H2N-A-B-C-D-COOH无水肼NH2NH2100℃5-10h。
A-NHNH2、B-NHNH2、C-NHNH2、D-COOH
氨基酸的酰肼,用苯甲醛沉淀,C端在上清中,Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。
B.羧肽酶法(Pro不能测)
羧肽酶A:
除Pro、Arg、Lys外的所有C端a.a
羧肽酶B:
只水解Arg、Lys
NH2N……………Val—Ser—GlyC
图P118羧肽酶法测C末端
肽链的部分裂解和肽段的分离纯化
化学裂解法
①溴化氰—Met—X—产率85%
②亚碘酰基苯甲酸—Trp—X—产率70-100%
③NTCB(2-硝基-5-硫氰苯甲酸)—X—Cys—
④羟胺NH2OH—Asn—Gly—
约150个氨基酸出现一次
酶法裂解
①胰蛋白酶LysX
(X≠Pro)
Arg——X
②胰凝乳蛋白酶Tyr——X
Trp——X
Phe——X
胃蛋白酶
Phe(Trp、Try、Leu)——Phe(Trp、Try、Leu)
③Glu蛋白酶Glu——X
(V8蛋白酶)
④Arg蛋白酶Arg——X
⑤Lys蛋白酶X——Lys
⑥Pro蛋白酶Pro——X
肽段的分离纯化
①电泳法SDS-PAGE
根据分子量大小分离
②离子交换层析法(DEAE—Cellulose、DEAE—Sephadex)
根据肽段的电荷特性分离
③反相HPLC法
根据肽段的极性分离
④凝胶过滤
肽段纯度鉴定
分离得到的每一个肽段,需分别鉴定纯度,常用DNS-cl法
要求:
SDS-PAGE单带、HPLC单峰、N端单一。
肽段的序列测定及肽链的拼接
Edman法
一次水解一个N端a.a
(1)耦联
PITC+H2N—A-B-C-D……pH8—9,40℃PTC——A-B-C-D……
(2)裂解
PTC—A-B-C-D……TFA无水三氟乙酸ATZ—A+H2N—B-C-D
(3)转化
ATZ—APTH—A
用GC或HPLC测定PTH-A
PTC肽:
苯氨基硫甲酰肽
ATZ:
噻唑啉酮苯胺(一氨基酸)
PTH:
苯乙内酰硫脲(一氨基酸)
耦联:
得PTC肽
一次循环裂解:
ATZ-
a.a
转化:
PTH-a.a
反应产率99%循环次数120
(偶联、降98%60
解两步)90%40
DNS-Edman法
用DNS法测N末端,用Edman法提供(n-1)肽段。
A-B-C-D-E肽
图
有色Edman法
荧光基团或有色试剂标记的PITC试剂。
用自动序列分析仪测序
仪器原理:
Edman法,可测60肽。
1967液相测序仪
自旋反应器,适于大肽段。
1971固相测序仪
表面接有丙氨基的微孔玻璃球,可耦连肽段的C端。
1981气相测序仪
用Polybrene反应器。
(聚阳离子)四级铵盐聚合物
液相:
5nmol20-40肽97%
气相:
5pmol60肽98%
肽段拼接成肽链
16肽,N端HC端S
A法裂解:
ONSPSEOVERLAHOWT
B法裂解:
SEOWTONVERLAPSHO
重叠法确定序列:
HOWTONSEOVERLAPS
二硫键、酰胺及其他修饰基团的确定
二硫键的确定(双向电泳法)
碘乙酰胺封闭-SH
胃蛋白酶酶解蛋白质
第一向电泳
过甲酸氧化—S—S—生成-SO3H
第二向电泳
分离出含二硫键的两条短肽,测序
与拼接出的肽链比较,定出二硫键的位置。
酰胺的确定
Asp–Asn、Glu-Gln
酶解肽链,产生含单个Asx或Glx的肽,用电泳法确定是Asp还是Asn
举例:
Leu-Glx-Pro-Val肽在pH=6.0时,电荷量是Leu+Pro0Val-
此肽除Glx外,净电荷为0,可根据此肽的电泳行为确定是Glu或是Gln。
糖、脂、磷酸基位置的确定
糖类通过Asn、Ser与蛋白质连接,-N-糖苷-0-糖苷
脂类:
Ser、Thr、Cys
磷酸:
Ser、Thr、His
经验性序列:
Lys(Arg)-Ser-Asn-Ser(PO4)
Arg-Thr-Leu-Ser(PO4)
Lys(Arg)–Ala-Ser(PO4)
蛋白质的一级结构与生物功能
蛋白质的一级结构决定高级结构和功能
蛋白质一级结构举例:
(1)牛胰岛素
Sanger于1953年首次完成测序工作。
P128图3-38
分子量:
5700dalton
51个a.a残基,A链21个残基,B链30个残基,
A链内有一个二硫键Cys6—Cys11
A.B链间有二个二硫键A.Cys7—BCys7
A.Cys20—BCys19
(2)核糖核酸酶(RNase)
P128图3-39
12600
124个a.a残基
4个链内二硫键。
牛胰RNase变性一复性实验:
P164图3-69。
(8M尿素+β硫基乙醇)变性、失活→透析,透析后构象恢复,
活性恢复95%以上,而二硫键正确复性的概率是1/105。
(3)人血红蛋白α和β链及肌红蛋白的一级结构
P129图3-40
同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化
同源蛋白质:
在不同的生物体内具有同一功能的蛋白质。
如:
血红蛋白在不同的脊椎动物中都具有输送氧气的功能,细胞色素在所有的生物中都是电子传递链的组分。
同源蛋白质的特点:
①多肽链长度相同或相近
②同源蛋白质的氨基酸顺序中有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的,称不变残基,不变残基高度保守,是必需的。
③除不变残基以外,其它位置的氨基酸对不同的种属有很大变化,称可变残基,可变残基中,个别氨基酸的变化不影响蛋白质的功能。
通过比较同源蛋白质的氨基酸序列的差异可以研究不同物种间的亲源关系和进化,亲源关系越远,同源蛋白的氨基酸顺序差异就越大。
细胞色素C
存在于线粒体膜内,在真核细胞的生物氧化过程中传递电子。
P130,图3-41
12500左右
氨基酸残基:
100个左右,单链。
25种生物中,细胞色素C的不变残基35个。
60种生物中,细胞色素C的不变残基27个。
亲源关系越近的,其细胞色素C的差异越小。
亲源关系越远的,其细胞色素C的差异越大。
人与黑猩猩0
人与猴1
人与狗10
人与酵母44
胰岛素
祥见P175胰岛素的结构与功能
不同生物的胰岛素a.a序列中,有24个氨基酸残基位置始终不变,
A.B链上6个Cys不变(重要性),其余18(24-6)个氨基酸多数为非极性侧链,对稳定蛋白质的空间结构起重要作用。
其它氨基酸对稳定蛋白质的空间结构作用不大,但对免疫反应起作用,猪与人接近,而狗则与人不同,因此可用猪的胰岛素治疗人的糖尿病。
蛋白质一级结构的个体差异—分子病
分子病:
基因突变引起某个功能蛋白的某个(些)氨基酸残基发生了遗传性替代从而导致整个分子的三维结构发生改变,致使其功能部分或全部丧失。
LinusPauling首先发现镰刀形红细胞贫血现是由于血红蛋白发生了遗传突变引起的,成人的血红蛋白是由两条相同的链和两条相同的链组成22,镰刀形红细胞中,血红蛋白链第6位的aa线基由正常的Glu变成了疏水性的Val。
因此,当血红蛋白没有携带O2时就由正常的球形变成了刚性的棍棒形,病人的红细胞变成镰刀形,容易发生溶血作用(血细胞溶解)导致病血,棍棒形的血红蛋白对O2的结合力比正常的低。
以血红蛋白为例:
α2β2寡聚蛋白
正常人血红蛋白,β.N......Glu6
镰刀型贫血β.N......Val6
生理条件下电荷:
Va10Glu-
疏水亲水
人的血红蛋白分子的四条肽链中(574个氨基酸残基)只有两个Glu分子变化成Va1分子,就能发生镰刀状细胞贫血病。
一级结构的部分切除与蛋白质的激活
一些蛋白质、酶、多肽激素在刚合成时是以无活性
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- 蛋白质 一级 结构 共价
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