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二、实验器材
1.药品与试剂:
营养琼脂粉、营养肉汤粉、半固体琼脂粉、蒸馏水、脓汁标本、粪便标本、普通营养琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板、斜面培养基管、液体培养基管、半固体培养基管、结晶紫染液(第1液)、卢戈氏碘液(第2液)、95%酒精(第3液)、稀释石炭酸复红(第4液)、香柏油、二甲苯、葡萄糖发酵微量管、乳糖发酵微量管、兔血浆、生理盐水、诊断血清、Muller-Hinton琼脂平板、青霉素滤纸片、链霉素滤纸片、庆大霉素滤纸片
2.器材:
1500W电炉、天平、称量纸、药勺、三角烧瓶、量筒、试管、刻度吸管、洗耳球、棉塞、牛皮纸、硫酸纸、橡皮筋、试管筐、尺、平皿、酒精灯、电炉、接种环、接种针、染色架、吸水纸、擦镜纸、打火机、笔、显微镜、小砂轮、载玻片、镊子、试管刷、冰箱、恒温培养箱
三、方法与步骤
1、培养基的制备:
培养基
称量干粉培养基(g)
水量(ml)
煮沸(次)
分装(ml)
备注
营养琼脂
11.4
300
2瓶,500ml锥形瓶,平板
2.9
75
3
5
15支,中试管,斜面
营养肉汤
1.1
50
1
15支小试管,液体
半固体琼脂
1.7
60
15支,小试管,高层
干粉培养基→蒸馏水→加热溶化→分装→集中放在试管筐里,然后罩上硫酸纸、牛皮纸,用橡皮筋扎好→放入讲台边的灭菌桶或灭菌筐内→送到髙压蒸汽灭菌室→灭菌(用于倒平板的培养基不用加热溶解,摇匀即可)
2、细菌的分离培养
平板划线分离法
甲→脓汁标本→营养琼脂平板(黄色)乙→脓汁标本→营养琼脂平板(黄色)
丙一粪便标本一伊红美蓝平板(紫色)丁一粪便标本一伊红美蓝平板(紫色)
方法:
(1)右手拿接种环(如握笔式),烧灼灭菌,欲伸入试管内的接种环杆部分亦要迅速通过火焰2~3次,以杀灭其表面细菌;
(2)左手握住盛有标本的试管的下端,右手以无名指、小指与手掌在火焰旁拔出试管棉塞并挟住之,将管口迅速通过火焰三次灭菌;
(3)立即将已灭冷却的接种环伸入试管内,沾取标本(或菌液)一环,试管口火焰灭菌后塞好棉塞;
(4)左手斜持平板,略开盖,在酒精灯火焰左前方约5~6cm处,将接种环上的菌液涂抹于平板表面的边缘部分;
(5)烧灼接种环,冷却后,从原涂抹部分开始,连续平行划线,每次只划平板的1/4~1/5,划毕后接种环再经火焰灭菌,冷却后用同样方法在平板其余部分划线,每次划线要与前次划线重叠1-3条,共计3^次(区);
(6)接种完毕,将接种环烧灼灭菌后方可放下;
(7)将培养皿倒置,37°
C培养34小时后,观察结果。
3、细菌的纯培养
斜面接种分工
甲→普通平板→黄色菌落→1支斜面乙→普通平板→白色菌落→1支斜面
丙→EMB平板→紫黑菌落→1支斜面丁→EMB平板→粉红菌落→1支斜面
接种环→套住菌落→轻刮取菌→接种环取菌后,伸入斜面底部,自下向上先拉→条细菌接种线→再伸入底部,自下向上,作蜿蜒划线→细菌涂布接种在斜面培养基的表面→斜面正面上2/3作标记:
组号、颜色→收集平板-灭菌桶内(平板底部朝下,盖朝上放置)→速送灭菌室→高压蒸汽灭菌→洗刷。
4、细菌的形态学检查
涂片→干燥→固定→染色
(1)涂片→干燥→固定
甲→黄色,紫黑。
乙→白色,粉红。
丙→黄色,紫黑。
丁→白色,粉红。
涂片:
①接种环取盐水3ulX2滴,水滴间距小于2cm;
②取菌苔少许(1mm小菌落半个)与盐水混勻,涂成大于lcm2;
③涂毕→环移至涂膜中央侧立,待环内菌膜破裂,接种环烧灼灭菌。
→干燥→固定:
手持载玻片→端,涂膜朝上,两个涂膜快速通过火焰外层3次,时间2〜3秒钟。
(2)革兰染色
涂片→干燥→固定→结晶紫→初染1分钟→水洗→卢戈碘液→媒染1分钟→水洗→95%乙醇→脱色约20秒钟—7尺洗—稀释品红—复染1分钟—水洗—吸干,镜检。
油镜使用方法:
10X物镜—看清标本—滴加香柏油—100X油镜—浸泡油中→模糊物象→细调节调焦,观察物像→记录结果→关闭电源→擦镜纸拭去香柏油—擦镜纸沾少许乙醇和乙醚(7:
3)混合液擦拭→擦镜纸擦拭油镜。
5、液体培养基接种(肉汤接种)
甲→黄色,乙→白色,
丙→紫黑,丁→粉红。
(1)接种环斜面取菌,在靠近液面的管壁上,上下研磨接种;
(2)在管壁上,将接种环内的菌膜拍破。
退出接种环,烧灼灭菌;
(3)标记:
组号,颜色
6、细菌的生化试验等
a.细菌的糖发酵试验
甲—紫黑菌苔—①葡萄糖乙—紫黑菌苔—②乳糖
丙→粉红菌苔→③葡萄糖丁→粉红菌苔→④乳糖
①用砂轮在糖发酵管液面上方2〜3cm处切割,然后,向切口外侧分离掰断,管口烧灼灭菌。
②接种针斜面取菌,伸入培养基内,在管壁上,上下研磨接种。
③退出接种针,烧灼灭菌。
④管口朝向相同,放置在平皿内。
b.抗菌素敏感性试验
纸片扩散法
甲→黄色菌液乙→白色菌液
丙→紫黑菌液丁→粉红菌液
①先取→环菌液;
②沿平板直径拉一条细菌接种线;
③再取一环菌液;
④旋转平板90度角,拉另一条接种线,使两条细菌接种线呈“十字形”;
⑤然后在平板上半部,作连续来回密集划线,每次划二分之一平板;
⑥旋转平板90度角,二次密集划线;
⑦旋转平板90度角,三次密集划线;
⑧旋转平板90度角,四次密集划线;
⑨设三点,呈等边三角距离;
⑩点距离平板边缘约15mm;
⑪作标记:
青、先、庆;
⑫镊子尖嘴朝下,夹取相应药物纸片的边缘,平贴在已设定的位置上,轻轻按压纸片。
c.血浆凝固酶试验
兔血浆+黄色,白色
①取二滴兔血浆(rabbitplasma)置于洁净的玻片上。
②分别用接种环取白色和黄色菌苔(约2〜3个菌落的菌量)与血浆研磨混合成直径8〜10mm的一层薄菌膜,立即观察结果。
③菌液出现明显凝块者为阳性,否则为阴性。
d.半固体穿刺接种法
甲→白色乙→金黄色
丙→紫黑丁→粉红
①接种针斜面取菌,从半固体中心,垂直刺入,到达培养基底部5分之4处,再循原来的路线,退出接种针;
②管口、接种针经火焰烧灼灭菌;
③标记:
组号,颜色。
7、细菌的血清学试验、结果分析
玻片凝集试验
(1)取洁净的载玻片一张,将磨面近端设为对照区,滴加生理盐水15ul。
远端设为试验区,滴加福氏志贺菌诊断血清15ul;
(2)用接种环分别取粉红色菌苔,约2个小菌落的菌量,研磨于盐水或血清内,混合均匀。
四、结果与讨论
(一)实验结果
1.洗手前后对比:
图1.1甲乙洗手前后图1.2丙丁洗手前后
空气的细菌学检查结果(实验室内,暴露在手机下):
图1.3空气的细菌学检查结果
CFU/m3=50000N÷
AT=50000×
13×
(3.14×
3.5cm2)×
40/m3=1118/m3
2.细菌的分离培养结果:
(1)脓汁标本在普通平板上有黄色、白色两种菌落,菌落的色素是脂溶性的,是细菌本身的颜色。
菌落直径2mm左右、圆形、隆起、表面光滑、湿润、边缘整齐、不透明。
(2)粪便标本在伊红美蓝平板上,有紫黑色、淡粉红色两种菌落,菌落色素是水溶性的,不是细菌本身的颜色,紫黑色菌落具有金属光泽、大而隆起、不透明的菌落,菌落直径2〜3mm;
粉红色菌落淡粉红色,半透明,直径1〜2mm.
(3)从四张平板画线的结果上来看,四张均有不足,得不到特别典型的菌落。
第一二张脓汁的营养琼脂平板,前面两区涂抹太密集,而板的其他部位未充分利用,得不到十分明显的菌落。
第三粪便的平板涂布时,用力过大划破平板,而第四张粪便的平板第一区太稀疏,未充分利用平板,故在培养后未见到数量较少的粉红菌落,原因是初次划线时,力度与划线的密度均未能很好地掌握,动作不熟练,不能连续划线。
图2.1甲,乙→脓汁标本→营养琼脂平板
图2.2丙,丁→粪便标本→伊红美蓝平板
3.细菌的纯培养:
在斜面培养基上得到四种菌体的纯培养标本,从普通平板上挑取的金黄色或白色菌落接种的斜面,菌苔的颜色,还是原来菌落的颜色,金黄色或白色。
从伊红美蓝平板上挑取的紫黑色或粉红色菌落接种的斜面,菌苔已经没有原来菌落的颜色。
菌苔灰白色、表面湿润、光滑、前者不透明,后者透明。
图3.1四种菌落在斜面培养基上生长情况
右左向右依次为金黄,白色,紫黑,粉红菌苔
4.细菌的形态学检查:
图4.1脓汁菌苔(左边为金黄色菌苔,右图为白色菌苔)
图4.2粪便菌苔(左图为紫黑色菌苔,右图为粉红菌苔)
镜下观察:
用普通平板,从浓汁标本中分离得到黄色、白色两种菌落,这两株细菌,显微镜油镜下均为G+球菌,排列不规则,呈葡萄串状,是典型的葡萄球菌。
结合菌落色素,这两株葡萄球菌可能是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。
用伊红美蓝平板,从粪便标本分离、获得紫黑色和粉红色半透明两种菌落。
紫黑色菌落可能是能分解乳糖的非致病菌大肠埃希菌。
粉红色菌落是不能分解乳糖的致病菌。
显微镜下,均为G-杆菌,散在排列,从形态上不能鉴别是什么细菌。
5、液体培养基接种
图5.1液体培养基接种结果从左至右分别为:
(①黄色细菌②白色细菌③紫黑色细菌④粉红色细菌)
6.细菌的生化试验等:
(1)半固体穿刺接种法
图6.1半固体穿刺
结果观察及讨论:
表1.动力试验结果
菌苔半固体实验
紫黑细菌1+
紫黑细菌2+
粉红细菌1-
粉红细菌2-
+:
阳性-:
阴性
1、紫黑细菌1和2细菌自接种部位向四周移动、扩散生长,培养基略微呈毛刷状或云雾状混浊状态,表明其有鞭毛。
结合其他组的结果,我们认为紫黑菌苔应当是动力阳性的。
2、粉红细菌菌苔均沿着直线生长,可看出其无鞭毛。
(2)细菌的糖发酵试验
图6.2糖发酵实验结果图.从左至右分别为:
(①紫黑→葡萄糖②紫黑→乳糖③粉红→葡萄糖④粉红→乳糖)
编号
菌苔
糖发酵管
反应现象
结果描述
符号
甲
紫黑
糖发酵管变黄色有气泡
分解X糖产酸又产气
⊕
乙
丙
粉红
糖发酵管变黄色无气泡
分解X糖产酸不产气
+
丁
④
糖发酵管仍紫色无气泡
分解X糖不产酸不产气
-
产酸或阳性⊕:
产酸产气-:
紫黑细菌微型发酵关内液体变黄,产生气泡,气泡的高度分别为10mm和17mm,说明紫黑色菌苔既分解葡萄糖也分解乳糖,产酸产气;
粉红细菌只分解葡萄糖,不
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