生物技术制药-课件第四章PPT课件下载推荐.ppt
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,三、细胞工程学及其内容1、细胞工程学(Cellengineering):
以细胞为单位,应用细胞生物学、分子生物学等学科的理论和技术,按人们的意志改变细胞的某些遗传特性,以达到改良或创造新品种的目的,以及使细胞增加或获得产生某种特定产物的能力,并通过在离体条件下进行细胞的大量培养、增殖,并从中提取对人类有用的产品。
它是一门应用科学和技术,是当今高新技术生物工程研究领域的重要组成部分。
2、细胞工程学的研究内容真核生物的基因重组、导入、扩增和表达的理论和技术;
细胞融合的理论和技术;
细胞器移植的理论的技术;
染色体改造的理论和技术;
转基因动、植物特性研究的理论和技术;
细胞大规模培养的理论和技术;
目的产物提取纯化的理论和技术,四、动物细胞在生物制药领域中的应用细胞虽小,但组成结构精密、复杂,有着巨大的生产效率,可生产许多维持机体生命所需的产物。
许多基因产物不能在原核细胞内表达,需要经真核细胞所特有的翻译后修饰,以及正确的切割、折叠后,才能形成与自然分子一样的功能和抗原性。
因此,动物细胞成为基因工程重要的宿主细胞,以生产多种非常重要的生物制品。
(1)利用动物细胞培养病毒来生产疫苗:
包括乙肝疫苗、乙脑疫苗、脊髓灰质炎疫苗、狂犬疫苗等。
(2)淋巴因子:
、和干扰素,1、2和6白细胞介素。
(3)酶原激活剂:
纤维蛋白溶酶原激活剂(ProUK),组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)等。
(4)单克隆抗体:
McAb(5)红细胞生成素:
EPO(6)其它:
第8因子、肿瘤坏死因子(TNF)、蛋白C、粒细胞克隆刺激因子(G-CSF)、上皮生长因子(EGF)及SOD等。
第二节动物细胞的形态和生理特点,一、动物细胞的结构和形态
(一)动物细胞的结构动物细胞的结构较原核细胞复杂得多,无细胞壁,有微管、微丝、微体、纤毛、伪足、微绒毛、胞饮沟、由核膜延伸形成的内质网、核糖体、高尔基体、线粒体、中心粒、酶原粒、核膜、核仁等。
(二)动物细胞的形态动物细胞不是靠一个细胞包办一切生理活动,各种细胞有明确的分工,相应有不同的形态。
这种随功能不同所产生的形态变化称分化。
肌肉细胞成纺缍形,起收缩伸展的作用。
神经细胞细长并有很长的分支和纤维,便于接受和传递刺激。
红细胞呈圆盘状,使与外界的接触面相对增大,有利于与周围环境交换气体和在血管内流动。
上皮细胞相互挤压成不规则的立方形、锤形等。
但这些分化的形态,当细胞离体培养时经常会发生变化。
(三)离体培养细胞的形态1、贴壁细胞(贴壁依赖型)anchoragedependent:
这类细胞生长必须有给以贴附的支持物表面,细胞依靠自身分泌的或培养基提供的贴附因子才能在该表面上生长繁殖。
当细胞在该表面生长后,一般形成两种形态。
纤维样细胞型主要来源于中胚层组织的细胞(成纤维细胞、心肌细胞、平滑肌细胞或成骨细胞等)。
离体培养时,细胞呈梭形或不规则的三角形,细胞群常连接成网,生长时呈放射状、漩涡状或火焰状。
上皮样细胞型主要来源于外胚层和内胚层组织的细胞,如皮肤、肠管和肺泡上皮细胞等。
贴壁培养时,细胞呈扁平的不规则的多角形,生长时彼此紧密连接成单层细胞片。
上述形态不是绝对的,会随着培养条件的变化而有所变化。
2、悬浮细胞(非贴壁依赖型)anchorageindependent生长不依赖支持物表面,可在培养液中呈悬浮状态生长,常呈圆形。
如血液内的淋巴细胞和产生干扰素的Namalwa细胞等。
3、兼性贴壁细胞有些细胞并不严格地依赖支持物,即可以贴附于支持物表面生长,还可以在培养基中呈悬浮状态良好地生长,这类细胞称兼性贴壁细胞。
在贴壁生长时呈上皮样或纤维样细胞的形态,而悬浮生长时呈圆形。
如:
中国地鼠卵巢细胞、小鼠L929细胞等。
二、动物细胞的生理特点动物细胞的培养与微生物和植物细胞的培养有很大不同,这是由动物细胞的生理和生长特点决定的。
1、细胞分裂周期长动物细胞分裂所需时间一般为1248h。
不仅随细胞种属的不同而不同,同一种属、不同部位的细胞所需的时间也不同;
培养条件如温度、pH、培养基的成分等,也会影响分裂周期的长短。
整个分裂周期=间期(G1期+S期+G2期)+分裂期(M期)G1期:
DNA合成前期。
S期:
DNA合成期。
G2期:
DNA合成后期。
细胞分裂一次,即传代一次。
2、离体培养常需贴附于基质,并有接触抑制(contactinhibition)现象
(1)贴附生长:
除少数悬浮培养的细胞外,大多数正常二倍体(diploid)细胞的生长都需在一定的基质(玻璃、塑料等)上贴附,伸展后才能生长增殖。
在无血清培养基内由于不能合成贴附因子,不能实现贴附生长。
(2)接触抑制现象(contactinhibition)当细胞贴附在基质上分裂增殖,逐渐汇合成片时,即每个细胞与周围的细胞相互接触时,细胞就停止增殖,若保持充足的营养,细胞仍可存活相当一段时间,但密度不再增加,该现象称之接触抑制或密度依赖抑制现象。
若细胞转化为异倍体后,该现象随之消失,细胞可多层生长,密度也可大大增加。
3、正常二倍体细胞生长寿命是有限的细胞离体培养开始,我们称为原代培养。
经传代后,即成为有限细胞系。
即使培养条件都很理想,有限细胞系也只能生长有限时间,经若干代传代培养后将逐渐死亡。
该时间的长短取决于种属和年龄。
人成纤维细胞可培养50代,鸡胚成纤维细胞可传代30代,小鼠成纤维细胞只能培养8代。
而且年龄越大,培养代数越少。
但在培养基中加入表皮生长因子,可使上皮细胞的培养寿命从50代增至150代。
当细胞经自然或人为的因素转化为异倍体后,可转变成无限细胞系,或称连续细胞系,此时细胞的寿命是无限的,更适合工业化生产的需要。
4、动物细胞对周围环境十分敏感动物细胞培养难度很大,对环境条件非常敏感。
因其无细胞壁,仅有细胞膜,一切能影响脂质和蛋白质分子变性的因素都会影响动物细胞的存活。
对多种物理化学因素,如渗透压、pH、离子强度、剪切力、微量元素等的变化耐受力很弱。
5、对培养基要求高不仅需要12种必需氨基酸,8种以上的维生素,多种无机盐和微量元素,以及碳源葡萄糖外,还需多种生长因子和贴壁因子。
6、蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同其蛋白质的合成除了在游离的核糖体上进行外(用于细胞质基质内),还在与糙面内质网上结合的核糖体上进行(分泌性的和膜中的整合蛋白)。
蛋白质的糖基化在高尔基体内加接的是O-链寡糖,在内质网中加接的是N-链寡糖。
原核生物由于缺少糙面内质网结构,无法对蛋白质进行糖基化和其他一系列翻译后修饰。
第三节生产用动物细胞的要求和获得,一、生产用动物细胞的要求什么样的细胞允许用以生产人用的药品,这是多年来人们争论的焦点。
1、早期的生物制品法规定只有从正常组织分离的原代细胞才能用来生产生物制品,如鸡胚细胞、兔肾细胞。
只要是二倍体细胞,即使经多次传代也可用于生产。
但非二倍体细胞是绝对禁止使用的。
这种规定极大限制了细胞的来源和更大规模生产的可能性,因二倍体细胞的寿命一般都不会超过50代。
人们担心异倍体细胞的核酸会影响到人们正常的染色体,而有致癌的危险。
2、近年来的规定取消了对异倍体传代细胞的限制;
需参照美国食品与药品管理局FDA对细胞株的要求,严格限制最终产品中残留的DNA量。
自20世纪80年代以来,一大批用异倍体传代细胞生产的产品被批准上市。
用Namalwa细胞生产的干扰素;
用杂交瘤细胞生产的单克隆抗体OKT3;
用猴肾异倍体传代细胞生产的狂犬疫苗等。
因基因重组的大量试验证明,DNA体外重组率极低(109),体内由于存在大量胞外核酸酶,外来的核酸更难被整合。
二、生产用动物细胞的获得用于生产的动物细胞主要有:
原代细胞、二倍体细胞系、可无限传代的异倍体转化细胞系(ContinuousCellLine)、以及用这些细胞进行融合和重组的工程细胞系(genetially-engineeredcellline),1、原代细胞是直接取自动物组织、器官,经过粉碎、消化而获得的细胞悬浮液。
由于组织块内常有多种细胞组成,而真正生产需要的只是其中的一小部分。
因此,用原代细胞来生产生物制品常需要大量的动物,费钱费劳力。
常用的有鸡胚、兔肾或鼠肾原代细胞,以及血液的淋巴细胞。
2、二倍体细胞系(有限细胞系)原代细胞经过传代、筛选、克隆,从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。
该细胞仍具备“正常”细胞的特点。
它的染色体组型仍然是2n的核型。
具有明显的贴壁依赖和接触抑制的特性。
增殖能力有限,一般可连续传代50代。
无致癌性。
一般从动物的胚胎组织中获取,广泛应用的有WI-38、MRC-5、2BS等。
3、异倍体转化细胞系这类细胞是通过某个转化过程,由于染色体的断裂变成异倍体,从而失去了正常细胞的特点,而获得了无限增殖能力。
(1)自发的转化过程:
正常细胞在传代过程中,大部分细胞随着传代次数的增加寿命逐渐终结,但其中有个别细胞可自发地转化而形成有无限生命力的细胞系。
这种转化多发生在啮齿动物。
(2)人为诱发在细胞培养过程接入某些病毒(如SV40)或加入某些化学试剂(如甲基胆蒽等),促进正常细胞转化成异倍体细胞系。
(3)直接从动物的肿瘤组织中分离制备的细胞系也是转化的细胞。
转化细胞系的特点:
具有无限增殖能力;
倍增的时间较短;
对培养条件和生长因子等要求较低;
更适于大规模工业化生产的需要。
近年来常用于生产的转化细胞系有:
Namalwa、CHO、BHK-21、Vero细胞等。
获取上述所需细胞,除原代细胞需靠自己临时用动物组织制备外,一般都可从各国的细胞库或有关细胞研究机构的细胞保存中心获取。
第四节动物细胞的培养特性和培养条件,一、动物细胞的培养特性动物细胞培养过程中具有以下特性:
1、生长缓慢,易受杂菌污染,培养时需加抗生素。
2、较微生物细胞大得多,无细胞壁,机械强度低,适应环境能力差。
3、培养过程需氧量相对较少,不耐受强力通风搅拌。
4、在动物机体中,细胞相互粘连以集群形式存在。
培养过程具有群体效应、锚地依赖性、接触抑制性及功能全能性。
5、培养过程产物分泌于细胞内外,反应过程成本高,但产品价格昂贵。
6、大规模培养时,不可套用微生物反应的经验。
7、原代细胞和二倍体细胞系一般繁殖50代即退化死亡。
二、动物细胞的培养条件要使动物细胞在体外培养成功,必须提供尽可能与体内生活条件相接近的环境条件。
(一)基本条件1、所有细胞培养用到的器材、设备和溶液都必须清洁和绝对无菌。
(1)器材和设备必须经严格的清洗一般需经过浸泡、刷洗、泡酸和冲洗4步。
用3%的磷酸三钠溶液浸泡过夜,泡酸一般用重铬酸钾洗液,再用水充分冲洗。
(2)器材、设备和溶液的消毒可采用紫外线、干热、湿热和过滤除菌等物理消毒法或使用各类化学消毒剂和抗生素等化学消毒法。
2、必须有足够的营养供应,绝对不可含有有害的物质。
即使是极微量的有害离子掺入。
3、保证有适量的氧气供应。
4、需随时消除细胞代谢中产生的有害产物。
5、有良好的适于生存的外界环境,包括温度、pH、渗透压和离子浓
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- 生物技术 制药 课件 第四