实验六PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测-教案Word文档下载推荐.doc
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【等电点】
在某一pH的溶液中,DNA分子解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等,所带净电荷为零,呈电中性,此时溶液的pH称为该DNA分子的等电点,用pI表示。
当DNA溶液pH>pI,-
当DNA溶液pH<pI,+
当DNA溶液pH=pI。
溶解度最小。
(2)分子筛效益
在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度主要取决于分子筛效益,即DNA分子本身的大小和构象(共价闭环DNA>
线状DNA>
开环DNA),而且其迁移速度与其相对分子质量的对数值成反比,所以不同相对分子质量的DNA分子可以在琼脂糖凝胶电泳中分离。
2.溴化乙锭对DNA分子进行染色的原理
观察琼脂糖凝胶中DNA最常用的方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。
溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂,用于观察琼脂糖凝胶中的DNA分子。
溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光,当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时,溴化乙锭从正极向负极移动,这样溴化乙锭分子就会嵌入到DNA分子中的碱基对之间形成络合物,这种络合物在紫外光下发射的荧光要比单纯的DNA分子要强的多,便于DNA的检测。
三、实验器材
1.电泳仪
北京市六一仪器厂,DYCZ-24DN型
2.移液枪:
5µ
l
3.微波炉
4.锥形瓶:
250ml
5.线手套
6.容量瓶:
1000ml
7.紫外分析仪
四、实验材料与药品
实验材料:
实验五中鸡血DNAPCR产物
1.DNAMarker
作用:
主要用途就是DNA分子凝胶电泳时,加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题。
通过其大小可以粗略估算样品DNA分子量的大小。
商品信息:
2000bp,50次,紫色液体
理化性质:
DNAMarker是分子量不同的DNA片段,主要成分Tris-HCl、EDTA、甘油、溴酚蓝
储存:
短期4℃保存,长期-20℃保存。
危害:
避免与皮肤眼睛接触。
2.GoldView核酸染色剂
一种可代替溴化乙锭(EB)的新型核酸染料,其灵敏度与EB相当,使用方法与之完全相同,在100ml琼脂糖胶溶液中加入5µ
lGoldView™即可。
在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光,也可用于染RNA。
1ml/瓶
室温保存2年。
虽然未发现GoldView有致癌作用,但对皮肤、眼睛会有一定的刺激,操作时应戴上手套。
【使用方法】
1.将100ml琼脂糖凝胶溶液(浓度一般为0.8%~2%)在微波炉中融化。
2.加入5µ
lGoldView,轻轻摇匀,避免产生气泡。
3.冷却至不烫手时倒胶,待琼脂糖凝胶完全凝固后上样电泳。
4.电泳完毕在紫外灯下观察。
【注意事项】
1.胶厚度不宜超过0.5cm,胶太厚会影响检测的灵敏度。
2.加入GoldView的琼脂糖凝胶反复融化可能会对核酸检测的灵敏度产生一定影响,但不明显。
3.琼脂糖
制备琼脂糖凝胶原料,分离和鉴定核酸。
100g/瓶
琼脂糖在水中一般加热到90℃以上溶解,温度下降到35-40℃时形成良好的半固体状的凝胶,这是它具有多种用途的主要特征和基础。
阴凉干燥处密闭储存。
无
4.三羟甲基氨基甲烷(Tris)
生物缓冲剂,用于凝胶电泳配置缓冲液。
500g/瓶
是一种白色结晶或粉末。
溶于乙醇和水,微溶于乙酸乙酯、苯,不溶于乙醚、四氯化碳,对铜、铝有腐蚀作用,有刺激性的化学物质。
有吸湿性,在阴凉干燥处密闭储存。
对眼睛、皮肤、呼吸道有刺激作用。
5.硼酸
TBE缓冲液成分之一。
分析纯,500g/瓶
为白色粉末状结晶或三斜轴面鳞片状光泽结晶,有滑腻手感,无臭味。
溶于水、酒精、甘油、醚类及香精油中,水溶液呈弱酸性。
有刺激性。
6.乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)
螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制脱氧核糖核酸酶(DNase)活性,活性依赖于钙离子,并能被镁离子或二价锰离子激活。
瓶/250g。
无味无臭或微咸的白色或乳白色结晶或颗粒状粉末。
溶于水,不溶于乙醇、乙醚,其水溶液pH值约为5.3。
可由EDTA与氢氧化钠和碳酸钙作用制得。
于阴凉、通风的库房。
远离火种、热源。
应与氧化剂分开存放,切忌混储。
配备相应品种和数量的消防器材。
储区应备有合适的材料收容泄漏物。
对粘膜和上呼吸道有刺激作用。
对眼睛、皮肤有刺激作用。
本品可燃,具刺激性。
7.6×
DNALodingBuffer
第一,里边的指示剂溴酚蓝和二甲苯氰FF起到指示的作用,显示电泳的进程,以便我们适时终止电泳;
第二,里边的成分甘油可以加大样品密度,使样品密度大于TBE,从而沉降到点样孔中,防止样品飘出点样孔。
5ml/瓶。
含溴酚兰、二甲苯青和甘油等,按5ul样品加1ulBuffer,混匀直接上样。
2-8℃两年。
五、实验试剂
1.0.5×
TBE(PH8.0)缓冲液
【5×
TBE缓冲液(PH8.0)】母液
{Tris108g+硼酸27.5g+0.5MEDTA20ml}®
定容到1000ml®
高压灭菌®
4℃保存
临用时用水稀释10倍®
0.5×
TBE缓冲液(PH8.0)
【0.5MEDTA(PH8.0)溶液】
水800ml+EDTA-2Na186.1g®
剧烈搅拌®
用NaOH调pH值至8.0(约需20gNaOH颗粒)®
定容至1L®
分装后高压灭菌备用。
注意:
EDTA-2Na在PH值接近8.0时才能完全溶解。
2.1.0%琼脂糖溶液
琼脂糖0.5g+0.5×
TBE缓冲液50ml®
放入锥形瓶中混匀®
微波炉中加热溶解
六、实验步骤
(一)1%琼脂糖凝胶的制备
1.选择合适的凝胶托盘放置于制胶器的合适区域。
2.称取1g琼脂糖置于250ml锥形瓶中,加入100ml0.5×
TBE缓冲液。
3.将锥形瓶放入微波炉中加热使琼脂糖充分溶解。
4.将5µ
lGoldView核酸染色剂加入其中,摇晃充分混匀。
5.待胶冷却至60度左右,将融化的琼脂糖小心的倒入制胶器中,速度要快,再把梳子(试样格)插入凝胶托盘两边槽内。
6.让胶自然冷却至完全凝固(约需20-30分钟)。
小心的将梳子拔出(注意先拔一侧),将胶连同凝胶托盘放入电泳仪中,加入0.5×
TBE缓冲液,使缓冲液没过凝胶1-2mm(注意加样孔靠近负极一端)。
如样品孔内有气泡,应除去。
(二)加样
1.将适量的DNAMarker用移液枪加入凝胶的第一个孔中。
2.在PCR产物中加入6×
DNALodingBuffer(每5ul产物加入1ul),混匀后,用移液枪加入到样品孔内,每孔加2ul。
3.盖好上盖,连接电泳仪电源与电泳仪之间的电泳导线,注意不要接错正负极。
4.调好电压,打开电源开始电泳,根据指示剂迁移的位置,判断是否中止电泳。
切断电源后,再取出凝胶。
(三)凝胶紫外观察:
凝胶取出于紫外监测仪或凝胶成像系统中观察,照相,保存,记录结果。
七、注意事项
1.琼脂糖融化时,档位不宜太高。
2.制胶和加样过程中要防治气泡的产生。
3.必须戴手套操作,严格注意防护。
4.加样时,Tip头不宜插入样品孔太深,也不要穿破胶孔壁,否则样品渗漏或DNA带型不整齐。
5.电源接通时,应核实凝胶的方向是否正确。
6.电泳仪有电压显示,并不一定标志电泳槽已接通,应观察电极气泡出现情况。
负极的气泡比正极多一倍,表示电泳已开始。
将两者混匀后加入点样孔,注意枪头尽量往下,同时防止气泡产生。
八、思考题
影响DNA迁移速率的因素有哪些?
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- 实验 PCR 产物 琼脂 凝胶电泳 检测 教案