AriaII操作手册-分选20160402Word文档下载推荐.doc
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AriaII操作手册-分选20160402Word文档下载推荐.doc
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8.达到100%,移去Closed-loop喷嘴,完成后点Done;
9.按照实验要求,插入直径合适的喷嘴(喷嘴直径应该是分选颗粒直径的3-6倍);
10.然后点OK,完成整个过程;
11.从菜单上选择Sort(分类)>
sortsetup,确认setup模式与喷嘴大小匹配。
(二)开液流
1.打开液流窗口的液流;
¨
点击软件界面上(如下图)的按钮
打开分选液流窗口(如下图)
点击分选液流窗口的按钮(stream的前面按钮),开启液流
2.打开分选仓前的门,检查液流。
液流应为一条细线落入废液槽正中(可通过调整红色标志的键);
(如果液流不稳,检查流动室中是否有气泡,将液流关闭,10秒钟后再开,排除气泡。
)
3.关上分选仓前的门。
(三)设定液流断点
1.调整液流震幅(Ampl),使断滴位于窗口上方1/3处。
(Ampl不要超过70,如果超过,检查流动室是否有气泡;
确认鞘液压力和震动频率是否合适);
2.确认卫星液滴与大液滴融合,应该在断滴的6滴之内融合(红色箭头数起,左图的左侧合格,右侧不合格),如果没有融合,重新安装喷嘴。
二、建立实验模板
1.在软件界面左侧Browser面板下,依次点击NewFolder、Experiment、Specimen(均可重命名),单击Specimen左侧“+”符号,显示下方的Tube,点击左侧灰色指示箭头,使之变成绿色(当前指示)。
2.在软件()Cytometer面板上,点击Parameters选项卡,选择实验所需荧光通道(按Ctrl键可多选),并删除多余通道。
选择荧光素名称、信号放大类型(log/lin)、信号脉冲类型(H/A/W),
3.在()右侧worksheet页面中,画出实验所需模板(斜箭头):
首先画出点图(双参数:
FSC-A和SSC-A),根据阴性对照(未染色的细胞)圈出细胞群P1;
其次画出点图(双参数:
荧光名称),利用鼠标右键ShowPopulations选项,选择P1,建立图之间的联系(如下图)。
4.至此,一个简单的实验模板基本建成。
现在可以将样本管放在上样台上,点击上样面板的load,此时AcquireData自动被激活或手动点击采集控制面板上的Acqiredata按钮,仪器开始获取样本数据。
5.根据实验情况调整Cytometer面板中各通道电压,使FSC/SSC中信号位于利于观察的位置(细胞群落在中央位置)。
调整阈值(Threshold),去除碎片和噪音信号。
调整上样速度(FlowRate)(最大为10)。
6.在FSC/SSC中调整门的位置、大小和形状,使之圈住感兴趣细胞群。
调节荧光通道的电压,使荧光信号位于合适的位置。
7.在鼠标右键中打开数据显示,观察实验的实时结果。
8.实验条件调整完毕后,在上样面板中设置EventsToRecord等参数,点击RecordData,开始保存数据。
(三)液流关机
预备关机
1.关激激光电源;
2.从上样架上移去上样管;
3.关闭液流(stream的前面按钮);
4.倒空废液桶;
5.加满酒精桶
关机
1.从菜单上选择Cytometer>
fluidicsshutdown(关闭),会弹出下面窗口
2.从流动室上移去喷嘴;
完成后点Done。
3.插入Closed-loop喷嘴,完成后点Done。
4.将鞘液桶的液流管和气管分别连接到酒精桶上,点Done。
鞘液桶
酒精桶
气管
液流管
从此处断开连接
液路关机时
正常运行时
5.按照提示,放上一管3ml清洗液,完成后点Done;
6.清洗完成后,按提示,点OK。
7.关闭流式细胞仪主机电源;
8.退出软件,关计算机。
清洗外部
用软布沾次氯酸钠和蒸馏水清洗分选仓、偏转板、上样架、分选收集架,进行消毒和避免形成盐结晶。
每日关机和日常维护
(一)日常关机
1.关闭液流
2.取下喷嘴,装上ClosedLoopNozzle。
3.从菜单上选择Cytometer>
>
CleaningModes>
CleanFlowCell,会弹出右侧窗口:
放一管无菌水在上样台上。
4.完成后,按要求点击OK;
5.用超纯水清洗ClosedLoopNozzle。
6.关闭流式细胞仪主机电源;
7.退出FACSDiva软件,关电脑。
FACSDiva软件介绍
DIVA软件界面如下:
在①工具栏中,可以显示或隐藏某个工作窗口
1、工作界面工具栏
保存(Save)-保存实验模板及数据。
直接退出软件时,软件将自动保存已建立的实验模板和已获取的实验数据。
浏览器(Browser)-点击可显示或隐藏浏览器窗口。
多孔板(Plate)-显示或隐藏多孔板实验窗口。
仪器设置(Cytometer)-显示或隐藏仪器设置窗口。
属性(Inspector)-显示或隐藏属性窗口。
工作表(Worksheet)-显示或隐藏工作表窗口
获取控制器(AcquisitionControls)-显示或隐藏获取面板
生物指数编辑器(BiexponentialEditor)-显示或隐藏生物指数编辑器
分选设置(Sorting)-显示或隐藏分选设置
2、各窗口介绍
2.1浏览器(Browser)
浏览器是创建实验模板和管理实验数据的窗口。
如图:
窗口第一栏的浏览器工具栏(Browsertoolbar)中包含了浏览器的所有构建模块,点击某个图标即可建立对应的项目。
从左至右分别是:
文件夹(Folders)、实验(Experiments)、样本(Specimens)、样本管(Tubes)、样本/样本管特异仪器设置(Specimen/Tube-specificcytometersettings)、分选版面(Sortlayout)、总工作表(GlobalWorksheet)、多孔板(Plate)。
各新建的项目均可用鼠标右键菜单重命名。
2.2仪器设置窗口(Cytometer)
仪器设置窗口是调节各通道电压、选择信号放大类型、脉冲类型、荧光补偿、阈值、激光延迟的界面。
2.3属性窗口(Inspector)
当鼠标焦点位于某个窗口或图像、数据框时,属性窗口内显示该焦点的相关设置。
2.4获取面板(AcquisitionDashBoard)
在获取面板中,用户可以控制仪器上样、获取数据、设置停止门、设置保存细胞数量。
2.5分选设置窗口(Sorting)
分选窗口包括两部分:
侧液流窗和断点液流窗
►侧液流窗中可以控制电压开关、测试液流、滤光片、废液抽屉、调整侧液流角度、液流聚焦、调整液滴延迟。
►断点液流窗可以开、关液流,开启断点监视(SweetSpot)、调整振幅(Ampl)、震荡频率(Freq)、设置Drop1和Gap值。
2.6工作表窗口(Worksheet)
在工作表窗口中,用户可以创建实验模板,包括直方图、散点图的绘制、各种门的创建以及进行数据分析。
实验模板建立常见问题
问题1:
在选择通道参数时,待选项中没有自己要选的荧光名称。
1.打开Cytometer菜单下的ViewConfigurations(视图设置)选项。
2.在跳出的窗口中双击仪器配置。
3.在新窗口的右侧Parameters中有各种染料的名称,将其拖拽至相应的检测器中。
完成后点击OK。
4.点击Setconfiguration,点击OK。
★若3中仍找不到所需染料名称,则可在2的Parameters选项卡中添加,然后完成3、4过程即可。
问题2:
如何在荧光通道中添加抗体名称?
1.在Experiment菜单下选择ExperimentLayout(布局)。
2.在新窗口的Label栏中添加抗体名称,完成后点击OK。
亦可选中同一列Label批量添加抗体名称
问题3:
如何调整荧光补偿?
手动调整补偿
以FITC/PE双染为例:
1.建立如下实验模板:
2.上阴性/同型对照(未染的细胞),调整参数的电压将细胞群调至第三象限(Q3):
3.上FITC单染样本,调整Cytometer面板Compensation(补偿)中的值,使阳性信号落入单阳性范围(如下图右侧)。
调整前后信号差别如下:
4.上PE单染样本,调整Cytometer面板Compensation中的值,使阳性信号落入单阳性范围。
5.荧光补偿调整完成。
★注:
若样品为多染,需分别制备单染样本,调整每对荧光通道组合之间的补偿值。
分选
一、液流监视
1.用蘸有超纯水的棉签擦拭偏转板,之后用干棉签擦拭干净。
整个分选过程都应确保偏转板无液滴或盐结晶。
2.打开液流,液流应为一条细线,无分叉、喷雾。
关闭液流罩。
3.调整仪器小激光的角度,使液流窗中的亮点最亮(下图圆圈圈的旋钮)。
4.调整Ampl值,使液流断点位置位于窗口中上部。
液流应类似于右图:
二、分选液路调整
1.打开Votage(电压)、TestSort,调整Ampl值,使液流窗的四个侧液流亮点距离最远、亮点最集中(若只做两路分选,可将两个外侧VotageSliders滑动器调至0)。
调整完毕后,输入断点液流窗的Drop1和Gap的实测值,点击SweetSport。
2.安装分选收集装置,打开WasteDrawer,调整VotageSliders,使侧液流分别流入各自收集管中。
关闭TestSort、Votage、WasteDrawer。
注意:
分选电压打开时,禁止触摸偏转板!
三、确定液滴延迟(DropDelay)
1.在Experiment菜单下选择NewExperiment,选择AccudropDropDelay,点击OK。
2.展开Specimen_001与Tube_001并激活Tube_001,双击SortLayout_001,界面会出现一个SortLayout对话框
3.将两滴BDAccudropBeads溶解在0.5mlPBS中上样。
将WindowExtension设为零。
调
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