TILLING(定向诱导基因组局部突变)技术原理及其路线优质PPT.pptx

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不依赖农杆菌介导转化或内源标签系统，无需耗时的基因操作和繁琐的组织培养。

但需要预先知道所研究基因的序列。

操作流程,操作流程1）用甲基磺酸乙酯处理种子诱导位点突变；

2）播种诱变处理种子，按单株种植得到诱变M1代植株；

3）播种M1代种子得到诱变M2代植株，自交获得M2代种子并保存建库；

4）按单株提取M2代组织DNA，存放于96孔微孔板建库；

5）5-8倍混合单株DNA库，构建DNA样品池以增加扫描通量；

6）针对目标基因设计特异性引物，采用700nm和800nm荧光染料标记引物，对DNA目标区域进行PCR扩增；

7）PCR的扩增片段经变性、退火，得到野生型和突变型碱基错配的异源双链核酸分子；

8）用特异性识别并切割错配碱基的核酸内切酶cel切割异源双链核酸分子，在错配位点单链的3端切开；

9）变性酶切产物得到完整单链（无突变碱基）和单链片段（突变点被切开所致）；

10）酶切产物采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；

11）用Photoshop对凝胶进行图像分析，如某一泳道有突变带，则在700nm和800nm的图像中，均会在野生型条带下方看到一个新的条带，这2个条带片段大小之和等于野生型条带长度，由新增2个条带的移动距离可以大体上估计突变距目标区域5或3的距离；

12）回溯发现带有突变的DNA池对应的保存样品，重复5-11过程锁定突变单株。

TILLING分析过程。

a.1）使用荧光染料标记基因特异性引物，对DNA池进行PCR扩增；

2）扩增产物经热变性，然后退火随机复性；

3）形成的错配双链DNA分子用S1内切酶切割，然后变性；

b.切割产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定，以确定基因发生突变的DNA池。

利用LI-COR凝胶系统的IRD700和IRD800两个通道测定5和3标记的PCR产物，产物大小可以确定突变点在扩增片段上的位置，在本例中大概离5端0.2kb，3端0.8kb的距离。

图.跑胶通道IRD800（左）和IRD700（右）的影像，诱变带被框出，IRD700中的截图标在最右边，注意一个通道的泳道浮现在背景上只有一个带，另一通道是相应的带，二者大小相加等于扩增产物的全长（最上端的带），胶下端泳道的若干的条带是随机错误引导所产生的小片段。

关键节点1）诱变过程诱发突变既可采用金典的化学诱变如EMS，也可以采用物理诱变如辐射诱变，或者利用自然突变群体。

诱变过程应进行小规模的预实验，通过对诱变效率和致使效应的折衷，选择适合的诱变剂量。

是一种单功能烷化剂，在体内可以转变成缺电子的活泼中间产物，容易与碱基上的原子和磷酸基团发生亲核取代反应，通过2条途径使基因突变。

一是碱基的烷基化效应，鸟嘌呤（）的位易被烷基化，形成带正电的季铵基团，产生种可遗传的效应：

）促进上的解离，使与配对，导致：

转换成：

；

）削弱了位的糖苷键，发生脱嘌呤作用，如果脱嘌呤位点在复制之前未被修复，则该位点在复制时将随机插入任何一个碱基，经过一轮复制后，可能发生：

到：

的转换，也可能发生：

或：

的颠换；

二是磷酸基团的烷基化效应，磷酸基上的原子被烷基化后，形成不稳定的磷酸酯，容易发生水解，使核苷酸从磷酸与五碳糖间切断，导致断裂，产生染色体缺失。

位点突变引起基因功能的改变主要包括：

错义突变，无义突变和剪接突变。

2）突变群体为了使突变能够产生分离表型变异，突变群体一般不选嵌合的M1代，而是选择突变M2代，但是若是花粉诱变则可以选择其M1代，如玉米品种。

在知道诱变频率的情况，产生目标基因突变所需要的群体大小可以估算。

3）DNA池为了提高分析通量，一般构建8倍的DNA样品池，如果品种的突变频率较高，突变群体较小时，样品池也可以较小。

构建基因池时,要确保各个单株的DNA等量混合，为此一般分析平台已采用机械手加样。

图.8倍池的构建策略。

4）SNP检测，酶切产物的凝胶电泳多采用的美国IE-Col公司的双色红外荧光检测的专利技术分析，因为红外光检测的背景低，700nm和800nm通道间间没有重叠，能有效的排除假阳性，可靠的发现和确定突变。

5）改进措施,图.高通量TILLING的服务组织，最新和最期待的改进。

Squinting指的是辅助凝胶检测，用当前使用的GelBuddy软禁确定新的DNA片段。

TbyS途径是指基于生物信息工具支撑的下一代测序技术在TILLING上的应用，在突变目的基因扩增后直接高速测序，或采用外显子俘获策略，使诱变DNA与转录组寡核苷酸杂交后再进行测序的途径。

图.（A）传统TILLING途径；

（B）适应于TbyS的途径,图.新一代高速测序流程图。

应用举例水稻,玉米,3）斑马鱼,参考文献1.High-ThroughputScreeningforInducedPointMutations.PlantPhysiol.2001,126：

4802.TILLINGbySequencing（TbyS）fortargetedgenomemutagenesisincrops.MolBreeding.2017,37:

143.TILLINGwithoutaplough:

anewmethodwithapplicationsforreversegenetics.CurrentOpinioninPlantBiology2005,8:

2112154.DiscoveryofchemicallyinducedmutationsinricebyTILLING.BMCPlantBiology2007,7:

195.DiscoveryofinducedpointmutationsinmaizegenesbyTILLING.BMCPlantBiology2004,4:

126.TILLING:

practicalsingle-nucleotidemutationdiscovery.ThePlantJournal（2006）45,684694,