THP-1培养(总结)Word文档下载推荐.doc
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3、细胞换液:
复苏过夜后,观察培养液有变黄(2-3天),此时换液,先把细胞液全部吸入15ml离心管中,900-1000r/min离心5min,(转速不能大于1000),吸掉上层培养液,加入新的1640,吹匀,全部吸到培养板中,37度培养。
4、传代:
悬浮生长细胞的传代:
有以下两种方法:
1、直接传代法:
①悬浮细胞自然沉淀瓶底;
②用吸管吸去上清1/2~2/3;
③轻轻吹打成细胞悬液;
④等分装入数个培养瓶(皿)
2、离心传代法:
①将细胞悬液转移到离心管内;
②800~1000r/min离心5min,弃上清;
③加新的培养液到离心管内;
④吸管吹打成为细胞悬液;
⑤分瓶(皿)
悬浮细胞传代,如果需要做实验大量扩增细胞的话,可以传代前先将培养瓶直立静置,待大部分细胞都沉降的细胞瓶底,勿晃动,轻轻吸出培养基,再加入新鲜培养基即可。
这样细胞数目不会损失多少,而且上层吸去的也是死细胞。
但建议加入新鲜培养基后分瓶扩增,毕竟一个较小的空间和有限的培养基环境下细胞扩增有限。
如果暂时不要做实验,只是维持传代的话,只要将大部分培养基吸去,留一点儿在瓶底,再加入新鲜培养基即可。
至于悬浮细胞何时传代合适,个人经验(我只养过THP-1和U937两种悬浮细胞)是待培养基变黄有些过,这时显示培养基已明显偏酸,对细胞并不适宜。
一般待培养基开始变黄,这时将细胞瓶放平,细胞能密密麻麻铺满整个瓶底就要传代了,这表明细胞的生长空间要不够了,就需传代分瓶扩增。
5、冻存液:
20%1640+70%胎牛血清+10%DMSO(ATCC里边有说明);
(7:
2:
1)
梯度降温冻存,4度,30min;
-20度,1h;
-80度,过夜;
然后转入液氮。
6、THP-1细胞是悬浮细胞,相对贴壁细胞要求高一点。
细胞养不好,可能的原因有,THP-1细胞特别依赖细胞浓度,ATCC上105到106每ML,是一个很高的密度,细胞少了就不太容易养好。
1、细胞株的来源很重要,如直接来源于ATCC(AmericanTypeCultureCollection美国模式菌种保藏中心)生命力要强于国内细胞库的
2、注意细胞的密度一定要高,介于5×
105——106/ML之间,增值的快。
细胞数量太少,不适合THP-1生长,一般状态不好的THP-1在培养了3天后数量仍然不多,继续培养一天或者两天,培养基严重泛黄,细胞数量会巨增。
这一点不同于同是单核细胞系的U937细胞。
3、THP-1细胞适合在细胞ph环境偏酸环境生长,对培养基变化非常敏感,所以尽量使用相同ph的1640,
4、还要注意,传代后切忌常移出培养箱观察,否则会影响细胞生长,状态变差,一般首先表现为细胞内颗粒变多。
一般THP-1生长相当快,对于状态已经不好的情况,建议传代后3~4天再观察,一般4天时间培养基已明显泛黄,细胞数量巨增。
1)THP-1细胞喜欢酸性条件,你不要老是换培养基。
越酸的条件,细胞密度越大,细胞就长得越好。
2)不要频繁换液,一般2-3次换液离心一次(只是补充培养基)
3)使用1640(ATCC推荐),注意加碳酸氢钠2.5g就可以了,宁酸勿碱
4)注意冻存的时候密度大些,推荐用血清冻存
5)感觉Hyclone的血清比较好
6)复苏比较慢,建议开始用小瓶,不要用一次性的
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