SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳.docx

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SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

ＳDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

实验目的:

测定蛋白质亚基的分子量及纯度

实验原理:

在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的点泳迁移率主要取决于亚及分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。

当蛋白质的分子量在15KD到2０0KD之间时,电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系,可以用来测定蛋白质亚基的分子量。

基本过程:

制胶、电泳、检测

试剂：

（储液由专业人员配置）30％丙烯酰胺单体储液、1０%过硫酸铵、TEMED、1.5mｏl／LTris－ＨＣl,pH8.8、1.0ｍol/ＬＴris-HCl,pＨ6.8、10%SDS、１0XTris-甘氨酸系统的电泳缓冲液、2Xloaｄｉｎｇbuｆｆｅr、水饱和正丁醇

器材:

灌胶支架、玻璃板、梳子、电源、加热器、电泳槽、扫描仪

实验操作程序：

1．安装灌胶模具,依照说明书进行

2．按照配方配置一定量（7ｃm模具配置1mm厚的胶配置5ｍl）的分离胶溶液和浓缩胶溶液（2ml）,过硫酸铵和TEMＥD在用前加入。

3．分离胶溶液充分混匀后从一侧加入灌胶模具,上方留约1.５-２cm用于加浓缩胶,小心的在分离胶的表面加一层水饱和正丁醇（或水饱和的异丙醇、水），封住胶面,以促使聚合并保持胶面平整。

4．室温放置40分钟到1小时后,可以看到一个界面,去掉上层覆盖液,用浓缩胶缓冲液淋洗胶面,然后灌制浓缩胶，并插入与模具大小相同，凝胶厚度相当的梳子。

5．静止放置40-60分钟使凝胶聚合，电泳液清洗样品孔。

6．制备好的蛋白质样品用2Xｌoａdｉnｇbufｆer1：

1混合，与分子量ｍarkｅr　一起10０℃煮3－5mｉn,　120０0rｐm离心5-10ｍin,（7ｃm模具、１mｍ厚度、10孔、考染上样量３0ug）

7．加入下槽液,把夹有凝胶的玻板转移到电泳槽，加入上槽液，上样。

8．连接电源，5-10mA/胶开始电泳，待溴酚蓝前沿到达分离胶后加大电流到10－15mＡ／胶,

9．溴酚蓝前沿到达玻璃板底部时停止电泳,取出凝胶,做好标记，准备染色。

10．染色。

见考马斯亮蓝染色操作规程及银染色操作规程。

11．扫描。

扫描操作见扫描仪的使用说明。

注意事项

1．在加过硫酸铵和TＥMEＤ之前溶液最好抽气,防止溶解在溶液里的分子氧在聚合时产生气泡使胶不均一。

2．过硫酸铵和ＴEMED的量应根据室温和聚合情况而定。

3．分离胶聚合后最好在4℃放置1２小时后再使用，以使凝胶充分聚合,改善电泳时的分辨率。

4．为防止气泡陷入，梳子应倾斜插入。

5．如果带着梳子过夜可能会影响分辨率,所以浓缩胶最好在使用前再灌制。

6．如果没有足够数目的样品，应在加样孔中加样品缓冲液，不要留有空孔,以防止电泳时邻近的带扩展。

7．对样品浓度不确定的情况下,加样时使用梯度加样法,能大致估计出样品的浓度。

参考文献：

1.《蛋白质电泳实验技术》郭尧君编著

固相pH梯度-ＳDS双向凝胶电泳实验操作程序

实验目的:

分离蛋白质混合物，将样品进行电泳后,为了不同目的在它的直角方向再进行一次电泳。

常说的双向电泳是根据蛋白质所带的电荷和分子大小对蛋白质混合物进行分离。

实验原理:

第一向等电聚焦的基本原理是利用蛋白质分子或其他两性分子的等电点不同，在一个稳定的、连续的、线性的ｐH梯度中进行蛋白质的分离和分析。

第二向运用ＳＤS聚丙烯酰胺凝胶电泳根据分子量大小对蛋白质进行分离。

基本过程:

等电聚焦、平衡及转移到二向、SＤS-PAGE

试剂或储液:

ＩPG　buffer、矿物油、ＤTT、碘代乙酰胺、过硫酸铵、ＴEMED、1ＭDTT、ｒehydｒationbuffer、平衡液储液、30%丙烯酰胺单体储液、1.５M　Ｔriｓ－ＨCｌ、10％　SDS、10XTris－甘氨酸系统的电泳缓冲液、0.５％琼脂糖、水饱和正丁醇、占位液

实验操作程序：

等点聚焦部分

1．根据选用的胶条的长度计算上样体积（见附1），加1MDTT到终浓度５0mＭ需要的体积,补加IPGbufｆer到终浓度０.２%或者0.5%的体积,加ｒehydration　buffｅｒ到该胶条的上样体积。

2．把各种溶液按计算的体积加入到epｐｅndorf管中,充分混匀,（或者超声5-10ｍin）1400０ｒpm，10℃离心５ｍin。

3．取出胶条室温放置10ｍｉn，平衡胶条的温度。

4．沿着聚焦盘中槽的边缘从左至右线性加入样品。

在槽两端各１cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。

注意:

不要产生气泡，否则影响到胶条中蛋白质的分布。

5．当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘中后，用镊子轻轻的去除预制IＰG胶条上的保护层。

6．分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+，安玛西亚胶条为尖端）对应于聚焦盘的正极（安玛西亚为尖端）。

确保胶条与电极紧密接触。

不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。

同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。

如果已经产生气泡,用镊子轻轻地提起胶条的一端,上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。

7．在每根胶条上覆盖1－3ｍl矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发析出尿素。

需缓慢的加入矿物油,沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。

8．对好正、负极，盖上盖子。

设置等电聚焦程序（见附２）。

9．聚焦结束的胶条立即进行平衡、第二向ＳDS-ＰAGE电泳,否则将胶条吸干矿物油置于平衡管中,-8０℃冰箱保存。

注意事项:

参见“双向电泳培训班讲义（定稿）”中等电聚焦注意事项部分。

附1：

胶条长度、上样量、上样体积、等点聚焦的伏小时数的设置及说明

胶条长度

7cm

１1cｍ

13cｍ

17ｃｍ

１８cm

24ｃm

上样体积

12５ul

18５uｌ

２５0ul

３０0ｕl

３50ul

450ｕl

银染上样量范围pH3-10L（ug）

5-100

15-20０

25-250

30-３0０

40－400

50-5０0

推荐使用量（ｕｇ）

5

00

250

银染VHrｓ

1２

０

５2０00

考染上样量范围ｐH３－10L（mg）

0．０5-0.５

0.15-1.2

0.25－1.5

0.25-２.５

0.75-3

１－4

推荐使用量（ug）

25

００0

12５0

考染VHrｓ

2２

０

62０0０

说明:

1．pＨ3－10ＮL,ｐH4－7，pH6-11的上样量与pH3－１0相比增加1.5－2倍，聚焦伏小时数延长约1０000ＶHr

２．按照推荐量上预实验,根据预实验结果调整上样量,样品中蛋白质分布均匀按推荐量使用,如果有高丰度的蛋白质适当降低上样量,如果显得少则适当加大上样量。

聚焦的伏小时数可以根据聚焦的情况进行调整。

附２：

等电聚焦程序的设置及说明

rehydｒａｔioｎａt20℃　4-８Hｒ

S1　　5０V　　　8-4Ｈr　快速

S２　　50０V　　　　1Ｈr　快速

S3　1000Ｖ　　　　1Ｈｒ　　快速

S4　　　8０00V　　1-2Ｈr　　　　　　线性

S5　　　80０0V　　见附1　　快速

说明：

1．一般无电压泡胀与低电压50V泡胀的时间加起来为12Hrｓ，无电压泡胀能够使小分子蛋白进入胶内，低电压泡胀能够使大分子量蛋白容易进入胶内。

依据感兴趣的蛋白质的分子量范围进行调节。

2．样品含盐量高时，最好把Ｓ4设置的时间再延长一些,或者在电极上加湿润滤纸条搭盐桥，避免烧胶。

3．７ｃm的胶使用最高电压40０0V来进行等电聚焦,如果某些样品达不到设置的80０0V／Hr，总伏小时数能够达到设置值也表明等电聚焦已经完成。

4．如果等电聚焦完成与转二向之间有几个小时的间隔,可以设置5０0V的电压来保持蛋白在胶里保持溶解状态。

平衡及SＤＳ-PAGE

1．安装灌胶模具,配置SDS凝胶。

具体操作见SDS－PＡGE、ＥTＴＡN　ＤALＴII　Syｓtｅm　以及ETTANＤALＴSＩX操作规程。

2．拿出适量平衡液融化平分到平衡管中,一半加入1％ＤTT,一半加入2.5％碘代乙酰胺，充分溶解。

3．等电聚焦完成后，关掉电源,用镊子夹出胶条，胶面朝上放在湿润的滤纸上。

另外一张湿润的滤纸覆盖在胶面上，轻轻吸去上面的油。

4．胶条支持膜紧贴平衡管壁放进含DTＴ的平衡液中进行还原,低速摇床上放置１5miｎ,把胶条取出来转入含碘代乙酰胺的平衡管中,烷基化打开的二硫键,低速摇床上放置15min。

5．小心将已平衡好的第一向胶条放置在胶面上,支持膜紧贴长玻板,轻轻压紧，胶条与胶面之间不要有气泡，胶条一端（一般为碱端）加入分子量marker,覆盖一层0.5%琼脂糖固定胶条。

6．电泳及染色。

见SDS-PAGE、ETTＡN　ＤALＴIＩSysｔem以及ETＴＡＮDＡＬTSIX操作规程。

注意事项:

剥胶后要注意切角以方便辨别。

常见问题及解决方案：

1.参考文献1p37－41

2.参考文献2p42-4４

3.参考文献3p２８３－286

4．参考文献5p4-6,p7,p８

参考文献:

（参考文献1-３在//bpi-serｖｅr＼ｐublｉc\ｒeferencｅs＼ＮEＷ\reｆerencｅ＼ｂｙproject＼双向电泳文件夹下）

1.2-ＤEｌｅctrophorｅsｉsusｉngImmｏbilｉzｅdpＨgｒadiｅｎｔs,priｎcipleｓ　andｍetｈｏds，安玛西亚公司操作手册

2.2－DElectｒophoｒesiｓforPrｏtｅomｉcs：

AMethodsandProdｕｃtManuａl.ｂiｏ-rad公司操作手册

3.PｒｏtｅｏmicsiｎPｒactice.　Ｄr.　Ｒeiｎeｒ　Westermeiｅr,　Ｄｒ．Tom　Ｎaｖｅｎ。

Wiｌeｙ－VＣHVerlａgGmbH

４．《肿瘤蛋白质组学》陈主初、梁宋平主编湖南科学技术出版社

5．双向电泳培训班讲义（定稿）

6．《蛋白质电泳实验技术》郭尧君编著

Weｓｔernblotｔinｇ　Ｐrotｏcol

一、试剂配方：

1XＴBＳ:

　　　　　　Tｒis-base　　　　１2.11g

Nacl　　　8．7７５g

用HCl调pH７．4,用纯水稀释至1L

5XTransfeｒbuffer:

　　　　Tｒis-ｂase　　　　１5.1g

Glｙcine　　　　　7２.０ｇ

To　　　　　　　　1　L

10Ｘ碱性磷酸酶缓冲液：

1moｌ／Ｌ　Tris-HCｌpH9．5

1ｍol／L　　　Nacl

50mmol/LMgCl２

TTＢS：

1XＴBS＋TＷＥＥN20（1000:

１）

碱性磷酸酶显色液：

2.5ｍＬ1X碱性磷酸酶缓冲液+１6.5µL　NBＴ混匀,再加8.2５µLBCIP混匀。

辣根过氧化物酶显色液:

10ｍL0．01mol/LpH7．６　Ｔris－HCl溶解6mｇ　ＤAB，滤纸过滤（-2０℃保存）,显色时加１0µL３0%H2O２（即按1000:

1加）。

二、实验操作：

1、SDS-PＡGＥ，胶在电转液：

1XTranｓｆerｂuffer　+20%甲醇+0.01%SDS　　　（800mL／８00µL　１0％SDS）平衡１0min。

2、处理尼龙膜:

１０0%甲醇浸泡５min,再加4倍体积的双蒸水，使甲醇终浓度为２0%,浸泡５mｉｎ。

１ＸTransferbｕffer＋２0%甲醇（无SDS）浸泡1０ｍin。

3、转膜：

按黑（—极）—海绵—滤纸—胶—膜—滤纸—海绵—白夹子（+极），（在电转液:

1ＸTransferbuｆfｅr+20%甲醇＋０.０1%ＳDS（800mL/8０0µＬ10％SＤS）中进行）夹好三明志夹，用冰包裹电泳槽，10０Ｖ或3５0mＡ转７0　min。

（注意底部靠其下槽，排除气泡,转完后切角作标记）。

4、封闭：

电转后膜用1XＴBＳ漂洗1次，置于５%脱脂奶粉中（1ＸTBS+１000:

1TWEEN20），封闭过夜，或者37℃,30　min~９0　min。

5、一抗:

抗体（抗体稀释比例根据自身实验具体确定，推荐比例：

抗血清常用１:

１00~１:

5000　5％牛奶，培养液上清1：

2~1：

10０，腹水1：

2００~1:

1０00０5％牛奶，）,震荡孵育1或2小时。

（一抗可回收冷冻保存）

6、TTBS洗三次，１0min/次。

7、二抗:

1:

１00０～500０TＴＢS稀释（常用1:

３00０），室温震荡孵育1小时。

8、TTBS洗三次,10mｉn/次。

9、显色：

将膜放在PＡRAＦIＬM膜上,滴加显色液5rpｍ（一般显色１mｉｎ即可，注意控制好时间,否则显色背景过深）。

1０、纯水终止显色,晾干或滤纸吸干保存。

考马斯亮蓝染色操作规程

实验目的:

聚丙烯酰胺凝胶上蛋白质的显色

实验原理:

考马斯亮蓝染料能与蛋白质的碱性氨基酸结合形成较稳定的复合物形式从而使蛋白质显色。

试剂：

固定液、染色液、脱色液

实验操作程序：

1．聚丙烯酰胺凝胶取下来后放置到盛有固定液的盘子里,摇床上轻摇固定30miｎ；

2．倒掉固定液，加入染色液，摇床上轻摇染色过夜或者３7℃保温2-3Ｈrs;

3．到掉染色液,加入脱色液脱色至点或条带清晰明亮，背景干净。

银染操作规程

实验目的:

检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质。

实验原理：

在碱性条件下,用甲醛将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银,以使银颗粒沉积在蛋白带上。

染色的程度与蛋白中的一些特殊的基团有关,不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染。

银染的详细机制还不是非常清楚。

试剂：

乙醇、冰醋酸、乙酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甘氨酸或EDＴA．Ｎa2.2H２Ｏ、甲醛

实验操作程序：

∙固定：

３0ｍin或者更长时间

o１00mｌ　乙醇　　　　　　４0%乙醇

o25ml冰醋酸　　　　　10%　冰醋酸 

o加水到250mｌ

∙致敏:

３0miｎ

o75mｌ　乙醇　　　　　　　　30%乙醇

o１７ｇ乙酸钠28.2g三水乙酸钠

o0.5g硫代硫酸钠

o加水到终体积２50ml 

∙水洗：

3ｘ10min 　

∙银染:

20min

o0．625gAgNO3

o１00　ul　　37％甲醛

o加水到终体积25０ml 

∙水洗：

　2　ｘ　1min （注意把握时间，水洗时间长显色速度慢,点的颜色偏黄色）

∙显色:

视情况而定

o6.25ｇNa2ＣＯ3

o50ｕｌ　３7%甲醛

o加水到终体积250mｌ　

∙终止：

1０min

o3.６5ｇEＤＴA.Na2．２H2O　或者1ｇ　甘氨酸

o加水到终体积250mｌ 

∙保存：

1%冰醋酸，4℃

注意事项:

1．固定时间较长,则加一步水洗３0mｉn,以免胶太脆而破碎。

2．甲醛在使用前加入。

3．最好多配制一份显色液，第一次显色到溶液变混浊时换一份显色液，显色到点清晰。

4．显色过程很快,要注意把握时间,避免染色过度。