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1.标准血清(抗体):
抗A分型试剂和抗B分型试剂各1支。
2.盛有1ml生理盐水的一次性试管1支。
3.一次性采血针1枚、白瓷板或玻片1块、一次性毛细吸管1支、75%酒精棉球和灭菌干棉球。
【方法】
1.用酒精棉球消毒被检者的耳垂或手指尖端,以采血针刺破皮肤,稍加挤压,使血液流出,滴1~2滴血液于含有生理盐水的试管内,摇匀,使成为血球悬液。
用灭菌干棉球止血。
2.取白瓷板1块,将抗A、抗B分型试剂分别滴加1滴于白瓷板的两个圆孔内。
3.用毛细吸管吸取血球悬液,在白瓷板的两个圆孔内各加1滴。
4.将白瓷板前后左右不停地摇动,使其充分混匀,5~10min后观察血球有无凝集发生。
如有凝集,可见红细胞凝集成块;
无凝集,红细胞呈均匀分散(图1)。
5.记录受检者红细胞凝集情况,根据ABO血型鉴定表,判断受检者的血型。
表1-1ABO血型鉴定表
抗A分型试剂
抗B分型试剂
血型
+
-
A
+
B
AB
O
红细胞不凝集红细胞凝集
图1红细胞凝集判断示意图
【注意事项】
1.采血前应对采血部位进行消毒。
2.采血针必须一人一针,禁止混用,严防交叉感染。
3.本法也可将血液直接滴在白瓷板或玻片上,而不必用生理盐水稀释,其结果不变。
(二)试管凝集试验
试管凝集试验是一种半定量的试验方法,常用于血清中抗体的测定,其浓度常以效价表示。
即将待检血清在试管内作一系列倍比稀释,然后加入相应的颗粒性抗原,使其在试管内发生直接凝集,以出现明显凝集(++)的血清最高稀释度为其效价(亦称为滴度)。
临床上常用的试管凝集试验有:
肥达试验(Widaltest)和外斐试验(Weil-Felixtest)。
1.诊断血清:
1∶10稀释的伤寒杆菌“O”及“H”诊断血清。
2.抗原:
伤寒杆菌“O”菌液(菌体抗原),伤寒杆菌“H”菌液(鞭毛抗原)。
3.生理盐水、小试管、吸管、试管架、水浴箱等。
1.取清洁小试管16支,分两排列于试管架上,每排8支,依次编号,每管内加生理盐水0.5ml。
2.用1ml洁净吸管吸取伤寒杆菌“O”诊断血清0.5ml加入第一排的第1管内,于管内上下吹吸3次,使血清与生理盐水充分混匀,吸出0.5ml加于第2管,同法混匀,吸取0.5ml加于第3管,依次稀释至第7管,从第7管吸出0.5ml弃去。
第8管为生理盐水对照。
稀释方法如图2所示。
图2血清倍比稀释法
3.同法稀释第2排的伤寒杆菌“H”诊断血清。
4.用1ml洁净吸管吸取伤寒杆菌“O”菌液,从第1排的第8管起依次向前在各管内加入0.5ml(表1-2)。
5.另取1支1ml吸管,同法于第2排各管中加入伤寒杆菌“H”菌液0.5ml。
6.将各试管振荡混匀,放入37℃水浴箱中2~4小时,初步观察结果后,置4℃冰箱过夜,次日再行观察。
单位:
ml
表1-2试管凝集试验加样程序
1∶10伤寒杆菌血清
对照
弃去
结果
37℃水浴箱中2~4小时,4℃冰箱过夜
血清稀释度
伤寒杆菌菌液
生理盐水l
试管编号l
【结果】
先观察第8管对照(图3),管底沉淀物呈圆形,边缘整齐,轻轻振摇细菌分散呈均匀浑浊,此为阴性。
然后从第1管起,逐管观察,如有凝集,可见管底有凝集块,边缘不整齐,液体澄清。
“O”菌液的凝集呈致密颗粒状,不易摇散,“H”菌液的凝集呈疏松棉絮状,易摇散。
凝集强度的判断以“+”号表示如下:
“++++”:
很强,细菌全部凝集,液体澄清,管底有大片凝集物。
“+++”:
强,细菌大部分凝集,管底的凝集物较小,液体微混。
“++”:
中等强度,细菌部分凝集,管底凝集物细小,但仍明显可见,液体半澄清。
“+”:
弱,细菌仅少部分凝集,液体混浊。
“-”:
不凝集,液体混浊与对照管相似。
以产生明显凝集(++)的血清最高稀释度为该血清的凝集效价。
不凝集凝集凝集摇动后
的现象
图3试管凝集结果示意图
1.加抗原时必须先从对照开始,然后从低浓度血清稀释度到高浓度血清稀释度依次加入。
2.“H”菌液的凝集很疏松,极易摇散,判断结果时应避免剧烈振动,以免影响结果。
注:
效价是指机体对抗原产生免疫应答时,其血清中含有特异性抗体的浓度,常以出现阳性反应的血清最高稀释度为效价(滴度)。
二、间接凝集反应
将可溶性抗原或抗体先吸附于适当大小的颗粒性载体表面(这种载体与免疫无关),然后与相应抗体或抗原结合,在适量的电解质存在下,出现特异性凝集现象,称为间接凝集反应(indirectagglutination)或被动凝集反应(passiveagglutination)。
这种反应适用于各种抗体和可溶性抗原的检测,其敏感度高于沉淀反应,因此被广泛用于临床检验。
其中将抗体吸附于载体表面检测抗原的间接凝集反应称为反向间接凝集反应。
根据载体的不同可将间接凝集反应分为:
间接血球凝集试验、间接乳胶凝集试验(及间接乳胶凝集抑制试验)和金黄色葡萄球菌协同凝集试验。
(一)间接血球凝集试验——血清类风湿因子测定
以红细胞为载体,将人丙种球蛋白(可溶性抗原)吸附在载体表面而成为致敏红细胞,然后用此致敏红细胞检测类风湿性关节炎患者血清中的类风湿因子(抗变性IgG抗体),当患者血清中含有类风湿因子时红细胞发生凝集。
此方法常用于检测血清中的抗体,辅助诊断疾病。
1.致敏红细胞悬液。
2.1∶10待检血清、阳性对照血清、稀释液。
3.V型微量反应板、微量移液器、微量振荡器、37℃恒温箱、移液头。
1.用微量移液器吸取稀释液加于微量反应板的1~9孔内,每孔50l,第10孔加50l阳性对照血清。
2.第1孔内加待检血清50l,混匀后吸出50l加于第2孔内,依次作倍比稀释至第8孔,并从第8孔中吸出50l弃去。
各孔的血清稀释度为1:
20、1:
40、1:
80……。
第9孔为阴性对照,第10孔为阳性对照。
3.将致敏红细胞悬液混匀,从第9孔起依次向前各孔内加入50l致敏红细胞悬液。
4.第10孔阳性对照加50l致敏红细胞悬液。
将反应板置于微量振荡器上,振荡1min,37℃静置30min后观察结果。
先观察第9孔阴性对照孔中的红细胞应紧密集中于孔中央,成为一红点(图4);
第10孔阳性对照孔中的红细胞应凝集并均匀地铺于孔的四周,孔中央无红细胞沉积的红点。
然后根据孔中红细胞凝集现象及其强弱程度,分别以“+”表示如下:
“+++”——红细胞凝集铺于孔的四周,有时因凝集过于强烈,会出现周边的凝集向孔心滑动的现象,此时应注意不要误判为阴性(阴性:
红细胞紧密集中于孔底,边缘整齐光滑)。
“++”——部分红细胞凝集,均匀铺于孔四周,孔中央可见疏松的红点。
“+”——红细胞沉积为环形,直径比对照的大,环四周有凝集现象。
“-”——红细胞紧密集中于孔底,边缘整齐光滑。
以“++”的血清最高稀释度作为试验效价,凝集效价>
1:
40判定为阳性。
图4红细胞凝集判断示意图
1.在进行多样本血清稀释时,极易发生操作失误,因此,操作要仔细。
2.加致敏红细胞悬液应从第9孔为阴性对照开始依次从低浓度向高浓度进行。
3.观察结果时应轻拿V型反应板,避免已凝集的红细胞从孔壁滑落,造成凝集效价下降或出现假阴性结果。
(二)金黄色葡萄球菌协同凝集试验
金黄色葡萄球菌细胞壁含有一种蛋白质,称为金葡菌A蛋白(staphylococcusproteinA,SPA)。
SPA具有与人和多种哺乳动物IgG的Fc段结合而不影响其Fab段功能的特性。
利用SPA这一特性,将已知的特异性抗体吸附于金葡菌上,与相应抗原发生的凝集反应即为协同凝集试验(coagglutination)。
此方法常用于未知抗原的检测。
1.抗A群脑膜炎球菌抗体致敏的金葡菌液、未致敏的金葡菌液、生理盐水。
2.毛细吸管、有格玻片。
1.在玻片的第1、2格分别加1滴致敏金葡菌液,第3格加未致敏金葡菌液。
2.于第1、3格各加1滴病人脑脊液,第2格加1滴生理盐水,将玻片轻轻摇动3~5min,观察结果。
第1格内细菌形成白色凝集,表明病人脑脊液中A群脑膜炎球菌阳性;
第2格为致敏金葡菌液对照,细菌不凝集;
第3格为未致敏金葡菌液对照,细菌也不出现凝集(图6)。
金葡菌凝集金葡菌不凝集金葡菌不凝集
图6协同凝集试验结果示意图
第1格第2格第3格
1.在操作过程中要不断地摇动玻片,同时注意避免相互之间混合。
2.气温较低的环境,应适当延长结果判断的时间,或提高实验环境的温度。
3.当凝集不明显,或结果判断困难时,可将玻片置于显微镜下观察,判断细菌是否有凝集现象。
实验二沉淀反应
可溶性抗原如血清、毒素、细菌浸出液等与相应抗体结合,当二者比例合适、并有适量电解质存在时,形成肉眼可见的沉淀物或沉淀线,称为沉淀反应(precipitation)。
参与沉淀反应的抗原称为沉淀原、抗体称为沉淀素。
由于参与反应的抗原为可溶性,分子小,单位体积内所含的抗原量多,与抗体结合的总面积大,因此,在实验中常常稀释抗原以保持抗原与抗体合适的比例,并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。
沉淀反应是免疫实验中最常用、最基本的方法之一。
它的种类较多,可分为琼脂扩散试验、免疫电泳试验、环状沉淀试验及絮状沉淀试验等。
一、琼脂扩散试验
利用可溶性抗原与相应抗体在半固体琼脂内进行扩散,当二者比例合适时,就出现白色沉淀线,此方法称为琼脂扩散试验。
本试验可在试管内、平皿中以及玻片上的琼脂内进行操作。
琼脂扩散试验可分为单向琼脂扩散试验和双向琼脂扩散试验。
扩散与电泳结合又有多种方法,如对流免疫电泳、火箭电泳及交叉免疫电泳等。
(一)单向琼脂扩散试验
单向琼脂扩散试验(singleagardiffusion)是一种定量试验。
将一定量的抗体与琼脂混合,倾注于玻璃板上,凝固后,在琼脂层中打孔,再将抗原加入孔中。
孔中抗原向四周扩散(分子量<
20万的物质,在琼脂中扩散犹如在液体中自由运动),在抗原与抗体的比例合适处,呈现白色沉淀环。
沉淀环的直径大小与抗原浓度成正比。
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- 试验 凝集反应