可溶性蛋白质含量的测定Word下载.docx
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但对不溶性蛋白和膜结合蛋白必须进行预处理(如加入少量的SDS)O
1.双缩腺法的原理双缩脉(NH2-C0-NH-C0-NH2)在碱性溶液中可与铜离子产生紫红色的络合物,这一反应称为双缩腺反应。
因为蛋白质中有多个肽键,也能与铜离子发生双缩腺反应,且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律,而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关,所以可用双缩腺法测定蛋白质的含量。
双缩腺反应主要涉及肽键,因此受蛋白质特异性影响较小。
且使用试剂价廉易得,操作简便,可测定的范围为1〜WMg蛋白质,适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定,能测出的蛋白质含量须在约05Mg以上。
双缩脉法的缺点是灵敏度差、所需样品量大。
干扰此测定的物质包括在性质上是氨基酸或肽的缓冲液,如"
Is缓冲液,因为它们产生阳性呈色反应,铜离子也容易被还原,有时出现红色沉淀。
2.福林-酚法的原理该方法是双缩脉法的发展,包括两步反应:
(1)在碱性条件下,蛋白质与铜作用生成蛋白质一铜络合物。
⑵此络合物将试剂磷钿酸一磷钩酸(Folin试剂)还原,混合物深蓝色(磷钿蓝和磷鹄蓝混合物),颜色深浅与蛋白质含量成正比。
此方法操作简便,灵敏度比双缩脉法高100倍,定量范围为5〜100yg蛋白质。
Folin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起,因此样品中若含有酚类、柠檬酸和疏基化合物,均有干扰作用。
此方法的缺点是有蛋白质的特异性影响,即不同蛋白质因络氨酸、色氨酸含量的不同而使显色强度稍有不同,标准曲线也不是严格的直线形式。
【仪器与用具】
试管若干;
刻度移液管05MI1支,1MI1支,10MI1支;
定量加样器;
圆底烧瓶;
冷凝管1套(带橡胶管);
微量滴定管;
小烧杯;
微量进样器50nI1支;
721分光光度计;
恒温水浴器;
研钵;
玻棒;
离心机;
离心官O
【试剂】
NA2W04・2H20;
NA2Mo04・2H20;
85%H3P04;
浓HCI;
L12S04・H20;
渙水;
酚駄指示剂;
NA2C03;
NAOH;
CuS04・5H20;
酒石酸钾钠;
牛血清白蛋白。
所用试剂均为化学纯或分析纯。
【方法】
1试剂的配制
(1)碱性铜试剂(相当于双缩腺试剂)的制备首先配制A液:
4%碳酸钠(NA2C03)溶液与02Mol/L氢氧化钠(NA0H)溶液等比例混合(2%
NA2C03,01MoINAOH):
B液:
1%硫酸铜(CuS04・5H20)溶液与2%酒石酸钾钠溶液等比例混合(05%CuS04・5H20,%酒石酸钾钠)。
在使用前将A液与B液按50:
1的比例混合即成。
此为Folin一酚试剂甲液,此试剂只能使用1天。
酚试剂(相当于Folln试剂)的配备:
称取鹄酸钠(NA2W04•2H20)100g>
锢酸钠(NA2Mo04・2H20)25g,加蒸徭水700MI溶解于1500MI的圆底烧瓶中。
之后加入85%的H3P0450MI,浓HCI100MI,安上回流装置(使用磨口接头,若用软木塞或橡皮塞时,就必须用锡餡纸包起来),使其慢慢沸腾10Ho冷却后加入硫酸锂(L12S04・H20)150g,水50MI,涣水2〜3滴,不用回流装置开口煮沸15Min,以释放出过量的渙。
待冷却后稀释至1000MI,并过滤入棕色瓶中,密闭于冰箱中保存(冷却后溶液呈黄色,倘若仍呈绿色,须再滴加数滴液体渙,继续煮沸15Min)o使用时用标准NAOH溶液滴定,以酚駄作为指示剂,滴定终点由蓝变灰,滴定后算出酸的浓度。
使用时大约加水1倍,使最终浓度相当于1Mol/LH+酸,此为FolIn-酚试剂乙液(FolIn试剂)。
在测定时要注意,因为酚试剂仅在酸性条件下稳定,但此实验的反应只在PH值为10的情况下发生,所以当加酚试剂时,必须立即混匀,以便在磷钿酸一磷鹄酸试剂被破坏前即能发生还原反应,否则会使显色程度减弱。
(2)标准蛋白质溶液的配制称取25mg牛血清白蛋白,溶于100MI蒸馅水中,使最终浓度为250Rg/ML
2标准曲线的绘制
(1)取7支试管,编号后,分别加入Oml标准蛋白质
溶液,用蒸镭水补足1MI,使每管含蛋白量分别为0ug、25ug、50ug、100ug、150ug、200ug、250ug(必要时可做重复)。
(2)在每支试管中用定量加样器加入5MI甲液,混匀,于30°
C下放置10Mino
(3)在每支试管中喷射加入05MI乙液,立即振荡混匀,在30°
C下保温30Min。
(4)准确到30Min后,以不加标准蛋白试管中的溶液为空白,在500nM下用1CM光径的比色杯对系列标准蛋白溶液进行比色,测定光密度值。
以蛋白浓度为横坐标,光密度值为纵坐标,绘制标准曲线。
3样品的测定
(1)样品的提取:
称取鲜样05g,用5MI蒸徭水或缓冲液研磨提取。
取10MI(视蛋白质含量适当稀释)样液加入试管中,然后重复步骤2的
(2)、(3)、(4),以标准曲线中的0管为空白,测定吸光值。
(2)根据吸光值查标准曲线,求出比色液中的蛋白质含量。
4结果计算样品中蛋白的含量(Mg/g)=CXVTV1XFWX1000(2-1)式中C:
查标准曲线值(ug);
VT:
提取液总体积(Ml);
FW:
样品鲜重(g);
V1:
测定时加样量(Ml)。
【注意】
还原物质,其他酚类物质及柠檬酸对此反应有干扰。
方法二:
考马斯亮蓝G-250染色法
考马斯亮蓝G-250(GooMAssleBrillIAnTBlueG—250)测定蛋白质
含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色,在稀酸溶液中,当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色,前者最大光吸收在465nM,后者在595nMo在一定蛋白质浓度范围内(1〜100ug),蛋白质与色素结合物在595nM波长下的光吸收与蛋白质含量成正比,故可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2Min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速,其结合物在室温下1H内保持稳定。
该反应快速灵敏(灵敏度比Folin-酚法还高4倍)、易于操作、干扰物质少(考马斯亮蓝G-250和蛋白质通过范德华力结合,受蛋白质的特异性影响较小,除组蛋白外,其他不同种类蛋白质染色強度差异不大),可测定微克级蛋白质含量,是一种比较好的蛋白质定量法。
但此方法也存在其缺点,考马斯亮蓝在蛋白质含量很高时线性关系偏低,且不同来源蛋白质与色素结合状况有差异。
10MI量筒1个;
烧杯;
量瓶;
移液管:
1MI3支,01MI3支;
10MI具塞刻度试管14支。
标准蛋白质溶液:
用牛血清白蛋白配成含蛋白质100ug/MI的标准蛋白溶液;
90%乙醇;
85%磷酸(W/V);
考马斯亮蓝G-250溶液:
称取100ug考马斯亮蓝G-250,溶于50MI90%乙醇中,加入85%的磷酸100MI,最后用蒸徭水定容到1000MI,贮放在棕色瓶中,此溶液在常温下可放置1个月。
【方法】1标准曲线(蛋白质含量为0〜100ug/MI)的绘制取6支具塞试管,按表2-1数据配制含0〜100^g/MI的牛血清蛋白质液各1MI。
表2-1不同蛋白质含量的牛血清蛋白质液配制表
管号123456蛋白质标准液(ml).蒸镭水(ml).蛋白质含量(ug)0100在每支试管中加入5MI考马斯亮蓝G-250溶液,盖寒,反转混合数次,放置2Min后,用1CM光径比色杯在595nM下比色。
以蛋白质浓度为横坐标,以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
2.样品提取液中蛋白质浓度的测定吸取样品提取液(样品提取见LoWry法),放入具塞试管中(每个样品设置两个重复),加入5MI考马斯亮蓝G-250溶液,充分混合,放置2Min后在595nM下比色,记录吸光值,并通过标准曲线查得蛋白质含量。
3结果计算
样品中蛋白质的含量(Mg/g)=CXVTV1XFWX1000(2-2)
式中C:
植物叶片可溶性蛋白含量测定
注意点:
1,考马斯亮蓝G-250所配溶液不稳定,所以每次实验都必须新配,且必须新做标准曲线;
2,考马斯亮蓝G-250配制完毕,如果发现溶液中有絮状沉淀,可以试用滤纸过滤后使用,如果实验中发现使用过滤后的考马斯亮蓝G-250溶液在与样品接触后短时间内便又发生絮凝,基本上推测该考马斯亮蓝G-250过期(比较容易出现)。
原理
植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类,测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。
在研究每一种酶的作用时,常以比活(酶活力单位/mg蛋白)表示酶活力大小及酶制剂纯度。
因此,测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。
常用测定方法有Lowry法和考马斯亮蓝G-250染料结合法。
考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色,当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色,前者最大光吸收在465nm,后者在595nmo在一定蛋白质浓度范围内(0〜100ug/ml),蛋白质一色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。
故可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速,其结合物在室温下1h内保持稳定。
该反应非常灵敏,可测微克级蛋白质含量,所以是一种比较好的蛋白质定量法。
试剂
(1)牛血清白蛋白配成J00|ig/ml;
(2)考马斯亮蓝G-250:
称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml90%乙醇中,加入85%(W/V)磷酸100ml,最后用蒸徭水定容至1000mIo此溶液在常温下可放置一个月;
(3)90%乙醇;
(4)磷酸(85%,W/V)o
方法
1.标准曲线的绘制
(1)0〜100^g/ml标准曲线的制作取6支试管,按表28-1数据配制0〜100|ig/nil血清白蛋白液各1mL准确吸取所配各管溶液,分别放入10ml具塞试管中,加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂,盖寒,反转混合数次,放置2min后,在595nm下比色,绘制标准曲线。
表28
- 配套讲稿:
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- 关 键 词:
- 可溶性 蛋白质 含量 测定