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质粒的提取与鉴定
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质粒的提取与鉴定
篇一:
11.20分生实验报告质粒DnA的提取、纯化与鉴定
实验四质粒DnA的提取,纯化与鉴定
DnA体外重组技术
【实验原理】
是在分子水平上,根据人们的需要以人工的方法取得感兴趣的目的基因,在体外与载体DnA分子重组,然后将重组分子转入受体细胞,并筛选出能表达重组DnA的活细胞,加以纯化、扩增,成为克隆。
【实验步骤】
1.分离或合成感兴趣的目的基因及载体---分
2.构建、改造作为载体的DnA------------切
3.目的基因与载体DnA在体外重组--------接
4.重组DnA引入受体细胞----------------转
5.阳性重组子的筛选、鉴定、扩增-------筛
【注意事项】
目的基因的获得:
1.从染色体DnA中直接分离
2.人工合成
3.由mRnA逆转录合成cDnA
4.从基因组文库中筛选目的基因
5.pcR获得
载体的选择:
1.DnA片段一同扩增;
2.
3.
4.载体分子应尽量小,可插入较大的外源DnA而不影响复制;
5.表达型载体应配备与宿主细胞相适应的启动子、前导序列、增强子等调控元件;
6.生物安全性好。
质粒DnA的提取
【实验原理】
质粒是细胞质中独立于染色体之外的能自主复制的遗传单位。
基因工程中的质粒一般是指细菌质粒,它可以随着细菌的细胞分裂将自己的遗传特性稳定的遗传给后代细胞。
质粒中除了复制、转录等相关的必需序列外,有一些DnA区段对于细菌来说并非必需序列,通过体外操作以目的基因取代这些非必需区段,这种改造的质粒就成为外源基因载体。
按照质粒载体的用途和其外源DnA的遗传信息能否表达可分为中间克隆载体(如pmD18-T)和表达载体(如peT-x、pbI121等)。
克隆载体所连接的的DnA片段一般没有启动子,因而不能转录,主要用于目的片段的大量制备。
表达载体按照宿主的不同有各种各样的原核表达载体(如大肠杆菌)和真核表达载体(如酵母、动物和植物),目的基因在载体上有完整的启动
子和终止子调控,可以在宿主细胞中转录并翻译成蛋白。
根据质粒在宿主细胞中复制调控机制的不同,可分为两类:
一类是“松驰型”质粒,如pmb1/cole1复制子,其复制受到一种称为RnAII的分子正向调控,不需要任何质粒编码的蛋白质,完全依赖于宿主提供的寿命较长的酶和蛋白质,因此即使在氨基酸饥饿或添加氯霉素等抗生素抑制蛋白质合成的条件下,其复制仍不停止,;二是“严紧型”质粒,如psc101,其复制伴随着RepA蛋白的合成,因此一旦蛋白质合成受阻,其拷贝数就不能增加,即在宿主的“严紧”控制下复制。
在分子生物学研究中,为了迅速扩增和提取大量的质粒DnA,通常使用的是“松驰型”质粒;但在某些特殊原因(如表达产物对细胞有毒性)下要求用严紧型质粒。
构型:
超螺旋型sc---结构致密跑得快电泳时最快。
开环型oc---体积最大,不易从胶孔中穿过。
线型Lc---居中。
碱裂解法抽提质粒DnA的原理:
基于质粒DnA与染色体DnA变性与复性的差异。
即利用solutionⅠ,Ⅱ,Ⅲ三种溶液分离提取质粒DnA,在ph=12.6时,染色体DnA完全变性,质粒DnA变性不完全;在ph=4.8时,质粒DnA复性,染色体DnA不能复性。
约67%体积分数的无水乙醇中,质粒DnA沉淀。
70%的乙醇起洗涤作用。
【注意事项】
1、质粒DnA提取过程中动作要轻柔,以免对DnA造成损伤
2、加solutionⅠ后一定充分打散悬浮菌体
3、加入solutionⅡ后放置时间不要超过5min,以免变性质粒不易复性
4、加入solutionⅢ后液体应由浑浊变为透明粘稠,可见拉丝现象。
若没有上述现象发生,则实验不能继续下去,应检查试剂配制及操作是否有误,然后重新开始
5、提取质粒后应尽量扣干,因为残留的乙醇可能影响后续实验
6、注意温和震荡和剧烈震荡的区别
电泳技术
【实验原理】
带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动的现象,称为电泳。
带有电荷的生物分子在电场作用下可发生移动。
由于混合物各组分所带电荷性质、数量以及分子量各不相同,在同一电场作用下,各组分的泳动方向和速度也各有差异,所以在一定时间内,它们移动距离不同,从而可达到分离鉴定的目的。
在一定ph条件下,每一种分子都具有特定的电荷(种类和数量)、大小和形状,在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同,各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。
这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。
常用的是琼脂糖凝胶电泳
一般用于核酸的分离分析。
琼脂糖凝胶孔径度较大,对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。
优点:
1.双重效应:
电泳效应、分子筛效应。
2.操作简单,电泳速度快,样品无需预处理。
3.电泳图谱清晰,分辨率高,重复性好。
4.凝胶透明且无紫外吸收,可在紫外灯下观看结果。
5.易染色,易洗脱,便于定量。
核酸分子的迁移率由下列几种因素决定:
(1)DnA的分子大小。
线状双链DnA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DnA分子量对数成反比,分子越大则所受阻力越大,也越难于在凝胶孔隙中移动,因而迁移得越慢。
(2)DnA分子的构象。
当DnA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。
相同分子量的线状、开环和超螺旋质粒DnA在琼脂糖凝胶中移动的速度是不一样的,超螺旋DnA移动得最快,而开环状DnA移动最慢。
如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DnA带难以确定是质粒DnA不同构象引起还是因为含有其他DnA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DnA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DnA图谱,则为同一种DnA。
(3)电源电压。
在低电压时,线状DnA片段的迁移速率与所加电压成正比。
但是随着电场强度的增加,不同分子量的DnA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。
要使大于2kb的DnA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。
(4)离子强度影响。
电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DnA的电泳迁移率。
在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DnA几乎不移动;在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DnA变性。
【实验结果】
上图即为实验数据
1;pgex-2Tx-sp1电泳结果可见两条带,即不太明显的RnA带和比较亮且明显的超螺旋DnA带;
2;puc18电泳结果可见四条带,从左至右依次为RnA带,超螺旋DnA带;线状DnA带以及开环DnA带。
【结果分析】
1、造成出现RnA电泳带的原因:
添加溶液时可能未充分混匀,导致RnA未与溶液中的RnA水解酶充分接触,从而导致有未水解的RnA参与电泳。
2、不同的DnA分子因所带电荷、分子量的大小和构型不同,在同一电泳系统中的泳动速度不同,可以彼此分离,出现不同的带。
3、出现线状DnA带以及开环DnA带的原因:
在提取过程中振荡过于剧烈导致DnA开环。
整体回顾与分析
亮点部分
1、因为之前有过移液枪的操作经理,所以本次移液枪操作符合规范
2、solutionⅡ现配现用,并且室温放置严格不超过5分钟,加入solutionⅡ、Ⅲ后,混匀溶液
3、注意了移液管量程的选择。
4、加入氯仿后的移上清液,未混入pr变形层
5、使用离心机的造作符合规范,并且严格控制时间。
6、每次出现换药品时都严格更换枪头,防止污染试剂。
7、加入70%的乙醇洗涤、离心后,充分干燥后才加入Te
不足部分
1、第一次加入solutionI时选错移液枪量程,导致小组实验重新开始。
2、部分移液步骤出现试剂沾在管壁上的情况
3、剧烈震荡时可能时间过短,程度不够深。
在中间步骤中时有几步出现无法混匀的情况
4、加入氯仿后,离心8分钟,仍有絮状物;再离心2分钟,依然有絮状物。
并未进行进一步处理便进行了上清液的提取。
5、在加入等体积氯仿和2倍体积无水乙醇时,因为无法测量体积,只能采取估算的方式,可能是本次试验的主要误差来源。
6、因为没有对此类实验废料的处理经验,导致部分实验废料被直接扔入垃圾箱。
篇二:
质粒提取、鉴定及保存,详细版
质粒提取、鉴定及保存
(1)质粒的提取(Tiangen质粒提取试剂盒):
a)挑菌:
选取培养板中大小中等的单个菌落,消毒牙签接种到10ml摇菌管中,其中含有卡那霉素的Lb约5ml,37°c,220rpm恒温摇床中震荡培养过夜。
b)取上述2.0ml培养液,于常温下12000rpm离心1分钟,弃上清,干燥沉淀。
c)加入250μl溶液p1(配有去RnA酶,4°c保存),涡旋振荡,完全悬浮细菌,不能留有沉淀,否则会影响裂解。
d)加入250μl溶液p2,快速上下颠倒8次,常温静置3分钟,可见混合液逐渐变清、粘稠,表示已充分裂解。
e)再加入350μl溶液Ⅲ,快速上下颠倒8次,可见白色絮状物出现。
f)常温12000rpm离心10分钟,所得上清液倒入已经用bL平衡过的过滤柱中,注意不要倒入白色絮状物沉淀,静置3分钟,12000rpm离心1分钟。
g)加入500μl溶液pD,12000rpm离心1分钟。
h)加入600μl溶液pw,12000rpm离心1分钟;此步骤再重复1次;弃废液后空管再次12000rpm离心2分钟。
i)于超净台通风干燥,放置2-5分钟,加入33μl已加热至65°c的已灭菌的ddh2o,室温静置3分钟,12000rpm离心2分钟,得到相关质粒DnA,测浓度,-20°c保存备用。
(2)质粒鉴定及保存
取100ng上述提取的质粒,进行酶切(反应体系见前),随后用0.8%琼脂糖凝胶电泳以鉴定(方法同前所述),最后将粗略鉴定正确的样本送至生物技术公司测序。
如测序正确,用50%灭菌甘油300μl+700μl的菌液,标记于-80°c保存备用。
11)质粒或pcR产物纯化(胶回收)
(1)琼脂糖电泳酶切或pcR相关产物。
(2)在紫外投射反射仪割取含有目的片段的琼脂糖凝胶片段,割取要迅速,以避免紫外线对DnA的损伤,但注意尽量割取目的片段,减少无目的片段的凝胶量,以便提高纯化回收效率。
(3)用天平称先称区空ep管重量,再称取含有凝胶的ep管重量,计算得到
凝胶重量(mg),加入等量体积(μl)bindingbuffer(如1mg=1μl)。
(4)将含有凝胶的ep管置入60°c恒温水浴箱中融化凝胶,持续8-10min,间或拿出摇匀,以确保完全凝胶溶解。
(5)将上述凝胶溶液转移至干净的纯化柱上,室温下静置吸附3分钟。
(6)将纯化柱12000rpm离心1分钟,弃超滤液,必要时可将超滤液重新离心1次可提供纯化效率;再次加入100μlbindingbuffer,12000rpm离心1分钟。
(7)加入700μlwashbuffer(事先已经加入无水乙醇),12000rpm离心1分钟,弃超滤液;空管12000rpm离心2分钟。
(8)纯化柱置于1.5毫升干净离心管中,于超净台通风干燥5分钟。
(9)加入30μl已加热至65°c的已灭菌的ddh2o,室温静置3分钟,12000rpm离心2分钟,得到相应的DnA片段,测浓度,-20°c保存备用。
篇三:
质粒的鉴定提取与纯化
质粒的鉴定、提取与纯化
一、菌落pcR法快速鉴定阳性克隆
1、菌落pcR引物的设计
①、为了最大程度避免菌落pcR出现假阳性结果,原则上应将引物的一端设计在载体上,另一端设计在插入片段上,长度25碱基足矣;
②、为减少非特异性片段的产生,同时保证两步法能够有效扩增出目的片段,建议将引物的Tm值设计在62-68℃之间;
注:
Tm值的计算请采用“最邻近法”(thenearestneighbormethod),该法计算准确度较高,为多种计算机软件所采用(需要相关软件的同学请到请无视之!
FTp上下载“molecular.biology.Insights.oligo.v7.37.zip”)。
金斯瑞引物合成单上的Tm值经验证完全不准,
③、引物设计时请适当考虑通用性,如插入片段为RxR,则可将引物设计在DbD区,相比之下,对这一区域做缺失研究的人较少,载体以pgL3系列载体为例,可将引物设计在荧光素酶的基因序列上,保证对pgL3-basic、promoter和enhancer均有效;
④、目的片段长度在500bp以上较为合适,一方面可以检测两段引物之间的序列是否出现缺失或插入,另一方面跑胶时条带也比较明显(碱基数越多则结合的染料越多)。
2、菌落pcR步骤
①、牙签挑取单菌落后,浸泡于200μL无抗Lb培养基中,旋涡混匀5-10s,使菌体在培养基中均匀分布;
注:
挑选单菌落时请挑个头中等,不大不小的菌落,这样的菌落呈阳性的概率较高。
一般情况下,含有空载体的菌生长较快,故菌落大,不宜挑取,菌落太小则无法区分是空载体菌落还是还有目的片段的菌落,亦不可取。
此为经验之谈,具体原因不明。
②、吸取1μL菌液作为模板,进行15μL体系的两步法pcR(68℃延伸,98℃解链),剩余菌液4℃存放备用;
注:
预变性(94℃)时间应延长至10min,使菌体破裂。
目标片段为1000bp左右时,20循环已足够,若目标片段为500bp左右,则建议进行25循环。
菌液(尤其是Dh5α)在接种前不可进行振荡培养,否则容易导致小摇失败(不长菌),经验之谈,原因不明。
③、pcR产物鉴定:
方法一(推荐):
取pcR产物(10μL左右),加Loadingbuffer后跑胶鉴定,凡没有特异性条带或泳道中明显的条带不止1条的,均可判定为阴性菌落,弃之。
方法二(不太推荐,赶时间的话可以试试):
在pcR产物(10μL左右)中直接加入用TAe按1/10稀释后的“ultrapower”荧光染料1μL,混匀后等待30s,之后于365nm紫外灯下观察颜色变化,溶液呈浓绿色的可认定为阳性菌落(即pcR能够扩增出产物,但是不是特异不好说,根据以往经验,该法产生假阳性的概率 ④、将阳性菌落所对应的菌液转接于20mL含抗培养基中,培养15-16小时,保种后提取质粒(如有必要,可送测序)。
二、质粒的提取与内毒素的去除
1、小提试剂盒提取质粒
①、取菌液16mL,平均分到4个离心管,离心后收集菌体,按小提试剂盒的说明书操作,提取质粒;
注:
16mL菌液裂解后,以两个吸附柱吸附即可(理论上可吸附80μg质粒),使用更多的吸附柱不会提高回收率(经验)。
另外,菌液多不代表质粒就提得多,16mL与20mL,在相同的裂解体系下,其质粒提取总量相差不会超过10%(经验)。
因此,使用过多的菌液除了增加产物中内毒素的含量外,无实际意义。
②、最后一步洗脱时,建议每个吸附柱加洗脱液(水或Te)100μL,洗脱一次后,再将洗脱液吸回吸附柱中,重复洗脱一次,一般情况下可提高洗脱率20%左右,同时建议暂时保留吸附柱,待检测质粒含量后再决定是否进行第三次重复洗脱。
若菌体长势良好,该步骤可获得质粒约60-75μg。
注:
采用更多地洗脱液有助于提高回收率,但过大的溶液体积将导致后续步骤(异丙醇沉淀DnA)中质粒的损失,故建议洗脱液用量为每柱100-125μL。
2、内毒素去除
①、取质粒溶液,加入0.125倍体积的3mol/L乙酸钠溶液(ph5.0),置于冰上预冷5min;
②、向预冷的溶液中添加0.125倍体积的去内毒素试剂(endotoxin-be-gone),混匀后在冰上静置10min;
③、将溶液转移到65℃水浴锅中,放置0.5-1min,此时可见溶液变浑浊;
④、取出浑浊液于12000rpm下离心2min,转移上清液;
注:
天冷时,③、④两步的间隔时间要短,动作要快,否则内毒素去除试剂将无法通过离心去除。
此外,室温在25℃以上时,内毒素去除效果较好,步骤②-④做两次即可,室温较低时,应做三次,以保证内毒素去除率。
3、质粒回收
方法一(沉淀法):
①、内毒素去除后,加入1倍体积的异丙醇,于12000rpm离心20min左右(可在室温下进行)或加入2倍体积的无水乙醇,于12000(本文来自:
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质粒的提取与鉴定)rpm冷冻离心20min左右,即可在离心管底部看见DnA沉淀;
②、若采用异丙醇沉淀,则用75%乙醇清洗沉淀2次(12000rpm,离心5min)除盐;若采用乙醇沉淀,则清洗1次足够;
③、弃去上清液,空干乙醇,溶解质粒。
方法二(吸附法):
内毒素去除后,加入0.4倍体积的3mol/L乙酸钠,取小提柱2根,将溶液均匀添加在吸附柱中,按试剂盒说明书回收质粒。
注:
两种方法对质粒的回收效果没有显著区别(回收率为70%-85%),但相对来说异丙醇沉淀法对操作要求较高,且耗时较长,故建议使用吸附法。
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