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脂肪酶发酵工艺

湖北大学

发酵工程与设备课程设计

题目脂肪酶的发酵工艺

专业年级08级生物工程

学生姓名文乐雷

学号2008221107100075

指导老师……..

2011年5月24日

1.脂肪酶的简介……………………………………………….2

1.1脂肪酶的定义………………………………………………2

1.2脂肪酶催化的反应………………………………………..2

1.3脂肪酶的结构特点…………………………………………2

1.4脂肪酶的特性……………………………………………..2

1.5脂肪酶的来源……………………………………………2

2.产脂肪酶菌株的筛选方法………………………………..2

2.1筛选路线……………………………………………………2

2.2初筛方法…………………………………………………..2

2.3复筛方法—摇瓶培养……………………………………….3

3.脂肪酶活力的测定………………………………………….3

3.1酸碱滴定法………………………………………………….3

3.2对硝基苯酯法……………………………………………….3

4.产脂肪酶微生物的培养基及培养条件…………………….3

5.脂肪酶生产的基本工艺流程图…………………………….4

6.南极假丝酵母生产脂肪酶………………………………….4

6.1菌种、培养基及试剂仪器………………………………….4

6.2发酵过程…………………………………………………..4

6.3脂肪酶的热稳定性和pH稳定性测……………………..4

6.4南极假丝酵母生产脂肪酶发酵条件研究………………..4

7.脂肪酶发酵生产过程………………………………………5

7.1分批发酵……………………………………………………5

7.2反复分批发酵………………………………………………5

7.3补料分批发酵……………………………………………..5

7.4连续发酵…………………………………………………..5

8.脂肪酶的固定化…………………………………………..5

8.1固定化脂肪酶的优、缺点…………………………………5

8.2脂肪酶固定化方法………………………………………..5

9.双水相体系提取脂肪酶…………………………………….6

9.1材料……………………………………………………………6

9.2分析内容……………………………………………………...6

9.3硫酸铵的定量分析…………………………………………….6

9.4试剂配制……………………………………………………….6

9.5相图节线制作………………………………………………….6

9.6双水相体系制备……………………………………………….6

10.脂肪酶在食品工业中的应用……………………………..6

10.1三酰甘油水解………………………………………………..6

10.2三酰甘油的改性……………………………………………..7

10.3催熟和发酵……………………………………………………7

10.4脂类合成………………………………………………………7

11.脂肪酶在其他方面的应用………………………………..7

11.1脂肪酶在纺织物中的应用…………………………………..7

11.2脂肪酶的医学应用…………………………………………..7

11.3脂肪酶在生物柴油中的应用……………………………….。

7

11.4脂肪酶在生物传感器中的应用……………………………….7

11.5在环境保护中的应用………………………………………….8

1、脂肪酶的简介

1.1脂肪酶的定义[1]

脂肪酶（EC3．1．1．3，Lipase）,又称甘油酯水解酶,是指分解或合成高级脂肪酸和丙三醇形成的甘油三酸酯酯键的酶。

脂肪酶是一类特殊的酯键水解酶，只作用于异相系统，即只在油水界面上作用，而且只有当底物以微粒、小聚合分散状态或呈乳化颗粒时，脂肪酶对底物水解才有显著的催化作用。

1.2脂肪酶催化的反应

反应

方程式

酯的水解

RCOOR’+H2O→RCOOH+R’OH

酯的合成

RCOOH+R’OH←→RCOOR’+H2O

酯交换反应

RCOOR’+R”COORR”←→COOR’+RCOOR

醇解反应

RCOOR’+R”OH←→RCOOR”+R’OH

酸解反应

RCOOR’+R”COOH←→R”COOR’+RCOOH

1.3脂肪酶的结构特点

脂肪酶分子由亲水、疏水两部分组成，活性中心靠近分子疏水端。

脂肪酶结构有2个特点：

（1）脂肪酶都包括同源区段：

His—X—Y—Gly—Z,Ser—W—Gly或Y—Gly—His—Ser—W—Gly（x、Y、w、Z是可变的氨基酸残基）；

（2）活性中心是丝氨酸残基。

1.4脂肪酶的特性

　　位置专一性：

是指酶对底物甘油三酯Sn-1（或3）和Sn-2酯键的识别和水解。

　　立体专一性一般是指酶对底物甘油三酯中立体对应结构的1位和3位酯键识别和选择性水解。

如猪胰脂肪酶水解甘油三酯时没有1和3位立体选择性;人奶和牛奶中脂蛋白脂肪酶优先水解1位酯键。

1.5脂肪酶的来源[2]

脂肪酶广泛存在动物、植物和微生物中而微生物脂肪酶种类最多,广泛存在于细菌、酵母和霉菌中,最易获得和大规模生产,且具有比动植物脂肪酶更广的pH、温度适应性,因此是工业用脂肪酶的重要来源。

　　细菌脂肪酶细菌脂肪酶大多数是胞外酶易于液体深层发酵,生产比较容易。

细菌脂肪酶大多数是碱性脂肪酶,且在pH4~11、温度30℃~60℃间具有良好的稳定性。

假单胞菌属的细菌脂肪酶应用最为广泛。

　　真菌脂肪酶真菌脂肪酶具有温度和pH稳定性、底物特异性以及在有机溶剂中具有高活性，且提取成本比较低等优点，因而发展迅速。

商业化的真菌脂肪酶主要有:

黑曲霉,米曲霉等。

2.产脂肪酶菌株的筛选方法

2.1筛选路线

采样→富集培养→初筛→复筛→检测酶活→鉴定菌种→保藏菌种

2.2初筛方法

可淘汰85％一90％不符合要求的微生物，利用平皿的生化反应进行分离。

①RhodamineB平板筛选法

筛选原理：

脂肪在脂肪酶的催化作用下水解生成甘油和脂肪酸，脂肪酸能与RhodamineB的阳离子发生作用，生成黄色的荧光物质，所以用紫外灯的观察，产脂肪酶的菌株周围会出现荧光圈，依据荧光圈的大小进行菌种的筛选。

②溴甲酚紫平板筛选法

筛选原理：

溴甲酚紫作为一种显色剂，其pH变色为5.2—6.8，在碱性条件下显紫色，在酸性条件下显黄色，脂肪在脂肪酶的催化作用下生成的脂肪酸会使培养基的pH降低，产脂肪酶菌株的周围会出现黄色的透明圈，根据透明圈的有无和大小来筛选产脂肪酶的菌株，透明圈越大说明产脂肪酶活力越强。

③琼脂块培养法

将分离培养基用灭菌的打孔器制作成许多单个的直径约0.6cm的小琼脂块,排放在干净的培养皿内,将挑选的菌株接种在这些小琼脂块上培养,让其充分生长,然后依次再将长满菌的小琼脂块放到酶活测定板上,28℃培养1～3d,观察各菌落周围油脂水解圈的大小,水解圈越大，酶活越强，将水解圈大的菌株纯化后保存在斜面培养基上。

2.3复筛方法—摇瓶培养

种子培养基→发酵培养基→收集菌体和上清液，分别测酶活。

3.脂肪酶活力的测定

3.1酸碱滴定法

　　反应体系：

橄榄油聚乙烯醇乳化液，0.025M、pH7.5的磷酸缓冲液，0.05NNaOH标准液，1%酚酞指示剂酶液。

　　步骤：

　　①加5ml缓冲液+4ml乳化液于三角瓶中，40℃水浴中保温10min；

　　②加1ml酶液，40℃反应15min；

　　③15min后立即加入15mL95%的乙醇终止反应；

　　④加酚酞指示剂2-3滴后用NaOH滴定到微红色，在30s内不消失为滴定终点，记下碱的消耗量，重复两次取平均值；

　　⑤作对照：

加缓冲液、底物后先加乙醇，在加酶液。

　　结果计算：

单位/克=（A-B）*n*f/t*w

3.2对硝基苯酯法

　　反应体系：

25mmol/L对硝基苯辛酸酯-异丙醇溶液，异丙醇-DMSO混合液，异丙醇：

DMSO=2:

1，100mmol/LTris-HCL缓冲液80mmol/LCaCL2溶液，酶液及灭活的酶液1%SDS

　　步骤：

　　①在试管中加入75ul异丙醇-DMSO、25ul底物、0.9ml缓冲液，100ulCaCL2溶液，37℃保温5min；

　　②五分钟后加入0.5ml酶液反应10min；

　　③10min后加入1ml1%SDS终止反应；

　　④作对照；

　　⑤用分光光度计测定OD；

　　⑥计算酶活。

4.产脂肪酶微生物的培养基及培养条件[3]

产脂肪酶微生物的培养基主要由碳源、氮源和无机盐离子组成。

到目前为止，据有关文献报道，用作脂肪酶发酵的碳源通常为葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、糊精、糖蜜、麦麸皮、小麦粉等碳水类化合物。

当然也有例外，有报道称菌株Acremonlumstrictum的最佳碳源是木糖（Okeko，1990），另有Geotrichumsp菌是利用油脂或者脂肪酸作为碳源；同时，大量研究表明：

不同的微生物种类，在发酵生产脂肪酶时对碳源的选择存在明显的差别（陈守文，1998）（黄家岭，2008）。

Yoshitaka的研究表明，Fe2+、Fe3+能促进Alcaligenessp产酶，而Ba2+、C02+则对其产酶活性则没有任何影响；据朱明华报道，无机离子K+、Na+、Mg2+、ca2+等对假单胞茵产脂肪酶活性具有促进作用，而Mn2+、Ba2+、Zn2+、Fe3+、C02+、Cu2+等则对该菌产脂肪酶活性具有抑制作用（朱明华，1991）。

另外，同种微量元素，不同浓度对菌株产酶活性的影响也不同，陶文沂报道称微量Ca2+可促进地霉产酶活性增强，而高浓度时则表现为抑制作用（陶文沂，1990）。

产脂肪酶微生物的常用氮源为黄豆饼粉、蛋白胨i牛肉膏、酵母粉、尿素、硝酸钠等。

与碳源类似，不同的氮源适用于不同微生物。

通常情况，复合氮源比单一的无机氮或有机氮作为氮源，更有利于提高微生物发酵产酶活性。

不同的菌株对氮源的要求不同：

Tsujisaka认为对于霉菌，发酵生产脂肪酶受氮源的影响比其它菌种要高；而菌株Mucorlipolytica、Aapergillusniger发酵产脂肪酶活性则受氮源的影响较小，动植物有机氮或尿素都能够满足其发酵产酶对氮源的要求。

发酵培养基起始pH对微生物脂肪酶产量有着显著影响，多数菌株最适pH为7-8。

Pal等通过对菌株Aspergillusniger的研究发现，始终保持pH7.0的发酵条件，该菌株产脂肪酶的量达到最大。

施巧琴通过对霉菌和细菌产碱性脂肪酶的研究发现，大部分霉菌在pH7.0培养基中产酶量最大而细菌则不同，多个种在发酵培养基pHl0条件下脂肪酶产量达到最大。

在具体的研究实践中，根据具体情况可加入一些特殊诱导物实现微生物产脂肪酶活性的提高。

常见的诱导物有甘油三脂、长链脂肪酸、游离脂肪酸以及他们的某些结构类似物如司班、聚乙二醇单油酸酯等表面活性剂。

对于诱导剂的选择，谢舜珍、陶文沂等研究表明，不饱和脂肪酸对脂肪酶的形成有明显的促进作用，而饱和脂肪酸则作用不明显。

另外有研究报道表明，脂肪酸酞基酯（吐温80，85作用效果最好）对菌株风纵面聊伽甜aeruglrosaEF2具有强烈的诱导作用，而油酸则起阻遏作用（谢舜珍，1986）；吴松刚报道，聚氧乙烯十二烷基醚、聚氧乙烯辛基苯基醚、聚氧乙烯十六烷基醚和土温40均能够不同程度地提高脂肪酶的产量，而咪唑则抑制脂肪酶的产生。

5.脂肪酶生产的基本工艺流程图

6.南极假丝酵母生产脂肪酶[4]

6.1菌种、培养基及试剂仪器

菌种为南极假丝酵母C.antarcticaDMS23855（本实验室保存）。

培养基组成:

（1）斜面培养基:

蛋白胨6g·L-1,酪蛋白水解物4g·L-1,酵母膏3g·L-1,牛肉膏1.5g·L-1,葡萄糖1g·L-1,琼脂20g·L-1

（2）种子培养基:

除去琼脂,其它成分同斜面培养基。

（3）发酵培养基:

Pharmamedia40g·L–1，酵母膏5g·L-1,蔗糖3g·L-1,豆油30mL·L-1,K2HPO44g·L-1,MgSO4·7H2O1g·L-1,聚醚0186mL·L-1,pH6.2。

试剂和仪器:

聚乙烯醇（平均聚合度1750±50）,分析纯,上海埃波化学试剂厂生产;摇床ZD285型恒温振荡器,常州国华电器有限公司;DS2Y215L型发酵罐,镇江达森发酵设备有限公司;alpha2DO1000型溶氧电极;alpha2pH800型pH电极,万通电子仪器有限公司。

6.2发酵过程

摇瓶培养:

50mL发酵培养基装于500mL的三角瓶中,回转式摇床,200r·min-1,24℃下,培养54h,接种量10%。

发酵罐培养:

10L的发酵培养基装于15L的发酵罐中,转速250r·min-1,通气量为10L·min-1接种量10%,24℃培养54h。

6.3脂肪酶的热稳定性和pH稳定性测定

南极假丝酵母在优化后的培养基中生长54h,取培养液在4℃下,5000r·min-1离心5min,除去菌体和培养基中其它不溶物。

在上清液中加入体积比为1∶1的冷的无水乙醇,充分搅拌后在4℃下5000r·min-1离心10min除去杂蛋白。

所得上清液中再加入体积比为215∶1的冷的无水乙醇,搅拌,4℃下,5000r·min-1离心10min,将沉淀溶解于合适的缓冲液中,用来分析酶的一些性质。

将酶液和pH范围为3.0～9.0的各种缓冲液按体积比1∶5的比例混合,在室温下放置24h,然后回调酶的最适反应pH,测定残留酶活。

在测定酶的热稳定性时,将酶液分别放置在30～80℃段不同的温度下60min,取出后冷却,然后在40℃下测定酶活。

6.4南极假丝酵母生产脂肪酶发酵条件研究。

刘均洪（2005.4青岛科技大学学报）等对南极假丝酵母生产脂肪酶发酵条件研究结论：

用南极假丝酵母进行脂肪酶生产,最优的培养基组成为:

豆粉40g·L-1,淀粉15g·L-1,豆油5mL·L-1,K2PO44g·L-1,MgSO4·7H2O1g·L-1,吐温-800.1%,酵母膏5g·L-1。

操作条件为:

温度24℃,初始pH6.0,通气量为10.0L·min-1。

在此培养条件下,发酵周期缩短到54h。

由15L发酵罐生产酶液的酶活达到19.2U·L-1。

酶液在pH为4.0～6.0和7.5～9.0段较稳定,其最适pH范围为6～8.5。

7.脂肪酶发酵生产过程

脂肪酶液态发酵可采用分批发酵,补料分批发酵,连续发酵,反复分批发酵;而固态发酵一般只见于分批发酵。

7.1分批发酵

大多数文献中多采用摇瓶发酵,另外,也可采用鼓泡式,气升式,搅拌式发酵罐.例如使用20L的分批生物反应器来研究Y.lipolytica胞外的影响因素（油酸甲酯在发酵液的分散度,溶解氧的变化,pH值的变更）,以在实验条件下模仿自然环境.这一系统能够模拟水压条件下大规模培养对微生物的生长,胞外酶的生产以及基因LIP2对脂肪酶的诱导作用.通过实验发现,溶解氧的变化对其生理效应有显著影响,而降低了基因LIP2的表达水平.油酸甲酯和pH值的变更仅对微生物体的产量及脂肪酶比生产率略有影响[5]。

7.2反复分批发酵

反复分批发酵同时具有分批发酵和补料分批发酵的优点,通过长周期控制生产过程,比分批发酵具有更高的效率.通过对R.arrhizus的液态反复分批发酵,实验中对培养基更换时间,体积以及最佳的组分进行了研究,其中九批在烧瓶中发酵140小时,六批在5L的生物反应器中进行.结果显示脂肪酶的产率在分批发酵中仅为3.1U（mL*h）,而采用反复分批发酵可提高到17.6U/（mL*h）[6]。

7.3补料分批发酵

补料分批发酵是指在发酵过程中加入一种或多种营养素以维持生物反应器中的生产.这种发酵降低了细胞新陈代谢对生产的影响,可避免酶作用底物和代谢产物对生产的抑制.Zhao等对皱褶假丝酵母进行高细胞密度发酵,在5L和800L下分别实验.在小试条件下,可通过指数加料及pH控制完成反应;而中试条件则需要两个阶段的发酵,在48小时处需微调培养温度和pH.结果在800L反应器中脂肪酶活性可达14,000U/mL,细胞湿重为500g/L[7].

7.4连续发酵

连续发酵是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基,同时以相同速度流出培养液,从而使发酵罐内的液量维持恒定的发酵过程.通过对皱褶假丝酵母胞内,胞外脂肪酶生产的连续发酵,实验者发现:

与分批发酵相比,连续发酵脂肪的产量提高了50%,并且在缺少氮源的条件下,脂肪酶活性将受到抑制[14].与分批发酵和补料分批发酵相比,连续发酵具有一定优势,产业化应用的潜力很大;可以通过多种方式实现连续发酵;应用连续发酵的前提是必须充分研究出发菌株的连续发酵特性;连续发酵理论与代谢工程理论等理论的结合是必须的;继续发展和完善连续发酵分子水平上的理论解释是下一步努力的方向[8]。

8.脂肪酶的固定化

8.1固定化脂肪酶的优、缺点

脂肪酶的固定化技术开始发展于20世纪后半期，与其它许多固定化酶一样，与游离酶相比，固定化脂肪酶也具有普通固定化酶的如下优点：

①生产实践中，固定化酶容易与底物、产物分开；②固定化酶可以实现在较长时间内进行的反复分批反应和装柱连续反应；③固定化酶的反应过程能够加以严格控制；④多数情况下，固定化能够提高酶的稳定性；⑤催化产物中没有酶的残留，简化了提纯工艺；⑥固定化酶可以增加产物的收率，提高产物的质量；⑦固定化酶较游离酶更适合于多酶反应体系；⑧固定化使得酶的使用效率提高，降低了生产的成本。

尽管有许多游离酶无法比拟的优点，但是固定化酶仍然存在一些不足：

①在固定化处理时，会引起酶活力部分丧失；②固定化处理增加了酶的制备成本，使得工厂初始投资加大；③固定化酶只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物，对大分子底物不适合；④与完整菌体相比不适宜于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应；⑤胞内酶必须经过酶的分离手续（袁勤生，2005）[9]（罗贵民，2003）。

[10]

8.2脂肪酶固定化方法

传统脂肪酶的固定化方法主要包括物理吸附（曹国民，1997）、包埋以及交联法和共价固定法四种，其中物理吸附、包埋法（鲁玉侠，2001）[11]为物理法，该法不但操作简单、成本低，而且由于酶分子与固定化载体间没有发生化学反应，所以对酶活性的影响较小；可美中不足的是，物理固定法不能有效地实现酶分子与载体牢固的结合，以至于酶分子容易脱离载体，从而严重影响固定化酶的稳定性。

交联法和共价固定法（杨永梅，2003）同属化学法，与物理法相比，化学法有效解决了酶分子与载体之间结合不够牢固的问题，但不幸得是，由于化学固定法是通过酶与载体之间发生化学反应而实现的，所以固定的过程往往造成对酶分子活性中心的破坏，从而严重影响酶的催化活力。

随着酶工程研究的不断深入，脂肪酶的固定化方法也不断得到发展和更新。

目前主要有交联酶晶体法（CLECs）（张虎，2000）[12]、CLAs固定化法、脂质包被固定化法（Lipid—coating）和硅基质包埋法（Sol—gelprocess）（Reetz，1995）（Reetz，1995）等。

其中脂质包被固定化法和交联酶晶体法，在有效增强脂肪酶的水解和酯化活性（Khalaf,1996）（Lalonde，1995）的同时，还有效地保证提高了脂肪酶的旋光选择活性和酶催化活性的立体选择特异性（Okahata，1995）；另外虽然硅基质包埋法脂肪酶回收率低，但相对于交联酶晶体法（CLECs）和脂质包被固定方法，该方法制备容易，并且能够提高酶的化学和热力学稳定性，还可以提高酶的立体选择性（张虎，2000）。

9.双水相体系提取脂肪酶

9.1材料

酶粉:

真菌（Geotrichumcandida）S56脂肪酶，PEG1000、PEG4000、PEG6000、PEG10000均为化学纯,实验中所用其他试剂均为市售。

9.2分析内容

脂肪酶活力测定：

测定方法见参考文献〔13〕.总蛋白含量测定：

测定方法见参考文献〔14〕由于蛋白质280nm波长有吸收峰,与Folin2酚法相比,简单方便用此法测定,蛋白质在10～100mg.mL-1范围内符Beer定律本实验以牛血清白蛋白为标准。

9.3硫酸铵的定量分析　　

（NH4）2SO4与HCHO（甲醛）作用,生成N4（CH2）6和H2SO4以及H2O,其反应式为:

2（NH4）2SO4+6HCHO——N4（CH2）6+2H2SO4+6H2O；

H2SO4+2NaOH=Na2SO4+2H2O。

用标准浓度的NaOH溶液滴定H2SO4,可用所耗NaOH的体积求得H2SO4的量,进而得出（NH4）2SO4的量计算公式:

W2=0.66*V*C

式中:

W2:

（NH4）2SO4在两水相中的量（g）；

V:

所耗NaOH标准溶液体积（mL）；

C:

NaOH标准溶液浓度（mol·L-1）。

9.4试剂配制

NaOH溶液的标定见参考文献[7].

20%酶液制备：

准确称取10.00g酶粉,先用少量pH8.5的磷酸缓冲液溶解,以2000r·min-1离心,再用上述磷酸缓冲液洗涤2次以上,然后于50mL容量瓶定容

其余试剂①40%PEG1000、40%PEG4000、40%PEG6000、40%PEG1000溶液;②40%（NH4）2SO4溶液;③25%PEG10000溶液④其余试剂参照文献[7]

9.5相图节线制作

从PEG量和（NH4）2SO4的量可得出其百分浓度,由此可得到两个点,这两个点与加料点的边线即为节线（Tieline）,得到一系列的点和节线即可连结各点作出一条曲线——双节曲线（binodal）。

它与节线构成一个体系相图[14]

9.6双水相体系制备[15]

　　实验在室温下进行按分配系数公式,相比R如下:

R=Vt/Vb，则物质在上相的提取率便为:

Yt=RK/（1+RK）。

Vt、Vb分别是上相和下相的体积K若分别用酶的分配系数Ke或总蛋白的分配系数Kp代替,则可以分别求得酶和总蛋白的提取率。

10.脂肪酶在食品工业中的应用

10.1三酰甘油水解

水解三酰甘油的常规方法是利用高温、高压水解的方法产生脂肪酸，此法能耗高，投资大，所得脂肪酸的质量较差。

脂肪酶水解法可以克服以上缺点且可以防止食品变质，因此备受人们青睬。

另外，由于脂肪酶的作用条件温和，专一性强，避免了常规法中极易出现的副反应，而且脂肪酸和甘油的颜色也不会发生改变。

脂肪酶酶促水解三酰甘油法可为食品工业提供优质的原料。

另一方面，脂肪酶作用下释放出的短链脂肪酸还可以改善食品的风味和香味。

恻如；用短链脂肪酸增香后的黄油具有一定的奶香味，可用来制造巧克力、奶糖、冰淇淋、糕点等。

还可以利用脂肪酶分解乳脂，用来制造脱脂炼乳。

10.2三酰甘油的改性

脂肪酶催化油脂改性，由一种甘油酯生成另一种甘油酯。

这对改善食用油的质量，开发食用油的品种，提高食用油的营养价值有很大的作用。

目前主要用于非水介质中脂酰残余物的选择怪替代以提高食用油的等级。

例如，脂肪酶催忧棕桶油莉硬脂酸发生反应生成的可可脂已广泛用于糖果工业。

据报道，