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论文纤维素酶半纤维素酶的提取
木耳菌糠木聚糖酶超声波提取工艺及酶学性质研究
摘要:
木聚糖是半纤维素的主要成分之一,广泛存在于各种植物资源中。
木聚糖酶是一类降解木聚糖分子的酶的总称,组成复杂,用途广泛。
但目前木聚糖酶生产成本高,价格昂贵,限制了其广泛应用。
而木耳菌糠中却含有一定量的木聚糖酶,且木耳菌糠廉价易得。
本试验利用超声波法进行单因子试验和正交试验从木耳的菌糠中提取木聚糖酶。
最佳工艺为:
振幅为80%;总时间为20min;超声时间为10s;固液比为1:
25,此时木聚糖酶活力最高为4.23(IU/g)。
经过酶学性质分析,最佳pH为4.6;最适温度为45℃。
关键词:
木耳;菌糠;超声波;木聚糖酶;提取工艺
TheTecnologyofExtractingXylanasefromAuriculariaAuriculaResiduewithUltrasonicMethodandEnzymologyPropertiesofCrudeXylanase
Abstract:
Xylanisamajorcomponentofhemicellulose,whichwidelyexistsinvariousplantresources.Xylanaseisakindofenzymewhichdecomposesxylanmolecules,hascomplexcompositionandisusedwidely.Buttheproductioncostofxylanaseishighandthepriceisexpensive,whichlimitstheirwiderapplication.Whilethereisacertainamountofxylanaseintheauriculariaauricularresidue,andtheauriculariaauricularresidueischeapandeasytoget.Inthisstudy,thexylanasewasextractedfromtheauriculariaauricularresiduethroughthesinglefactorandorthogonaltestswhichwasconductedwithultrasonicmethod.Theresultsshowthattheoptimumextractingtechnologywasthatamplitudewas80%;totaltimewas20min;ultrasonictimewas10s;solid-liquidratiowas1:
25,thehighestxylanaseactivityundertheoptimumextracingtechnologywas4.23IU/g.TheoptimumpHandtemperatureofxylanasewas4.6and45℃.
Keywords:
Auricularia;Auricularesidue;Ultrasonicwave;Xylanase;TechnologyofEctracting
目 录
1前言1
2材料与方法2
2.1材料2
2.1.1原料及其处理方法2
2.1.2主要仪器2
2.1.3主要试剂及配制方法2
2.2方法4
2.2.1木聚糖酶粗酶液制备4
2.2.2木聚糖酶活力测定方法4
2.2.3单因素试验5
2.2.4正交试验设计6
2.3作图及数据统计分析6
3结果与分析7
3.1单因素试验结果7
3.1.1振幅对提取木聚糖酶的影响7
3.1.2总时间对提取木聚糖酶的影响7
3.1.3超声时间对提取木聚糖酶的影响8
3.1.4固液比对提取木聚糖酶的影响8
3.2正交试验结果与分析9
3.3提取次数10
3.4木聚糖酶酶学性质11
3.3.1pH对木聚糖酶活力的影响11
3.3.2温度对木聚糖酶活力的影响11
4结论12
参考文献13
致谢14
1前言
纤维素、半纤维素是地球上最丰富的有机物质,是植物秸秆、糠壳、木材、纸张、棉和农副产品的主要成分,是人类最经济、最广泛的自然资源。
据资料表明[1],植物每年通过光合作用能产生高达1.55×1011吨纤维素类物质,其中纤维素和半纤维素的总量为8.5×1010吨。
而每年能真正用于工业生产的纤维素类物质微乎其微,绝大多数都被浪费掉了。
而究其原因,主要是因为生物转化的成本过高和酶的降解率低。
目前,除少量的纤维素资源被作为建材、纸张、饲料等被人们加以利用外,其余的都被当作废物处理了,甚至造成环境污染。
因此,如何提高纤维素类物质的利用率成为了人们一直关注的课题。
20世纪末期以来,在纤维素类物质的实践应用方面取得了较大进展,建立了纤维素资源生物量利用工业模拟实验系统[2],采用化工与生化工程等,大大提高了纤维素类物质的利用率。
目前,对半纤维素的利用主要是利用生物手段,即利用微生物将纤维素类物质分解为糖类的特性,把大量的纤维素类物质转化为工业酒精和饲料等,来缓解全球能源危机和资源紧张的现状。
而对于半纤维素酶的利用却很有限,最主要的原因还是因为半纤维素酶的生产总量不足,且成本较高,所以不能被人们广泛利用。
半纤维素酶的主要成分是木聚糖酶,它是最主要的水解酶。
本课题主要研究从酶的角度对自然界中的纤维素类物质的利用,即利用试验方法从出耳后的菌糠中提取木聚糖酶,研究其最佳提取工艺和最佳酶活条件,来加大半纤维素的利用率,对半纤维素的利用和木聚糖酶的实际生产具有重要意义。
本试验主要讨论利用超声波原理对木聚糖酶的提取。
超声波是一种机械波,它的机械作用主要是辐射压强和超声压强引起的。
辐射压强可能引起两种效应:
其一是简单的骚动效应;其二是在溶剂和固体之间出现摩擦。
这种运动可以使样品组织表面变形。
超声压强将给予溶剂和样品固体以不同的加速度,使溶剂分子运动的速度远大于样品固体的速度,在它们之间产生摩擦,这种能量相当大,甚至能打开两个碳原子之间的化学键,导致大分子物质分解或解聚[3]。
从而使细胞破碎,得到目标产物。
2材料与方法
2.1材料
2.1.1原料及其处理方法
木耳试验样品取牡丹江市绿珠果蔬技术开发有限责任公司(黑龙江省牡丹江市东安区兴隆镇西村)。
随机取10袋木耳菌糠,脱去菌袋,摘掉菌糠表面的菇蕾,搓碎后均匀混合。
2.1.2主要仪器
高速组织捣碎机(DS-1;上海标本模型厂制造);分光光度计(722N;上海精密科学仪器有限公司);移液器(10~1000μL);分析天平(BP-211D;沙多利斯(俄罗斯));恒温水浴锅(HH-601超级水浴锅;江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司);振荡培养箱(HZQ-F160;哈尔滨市东联电子技术开发有限公司);控温离心机(TGL-ULM;湖南星科科学仪器有限公司);pH计(PHS-2F;上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂);烘干箱(GR-146;上海博迅实业有限公司医疗设备厂);超声波破碎仪(输出功率100W)(VCX-130;美国Sonics公司)。
2.1.3主要试剂及配制方法
2.1.3.13,5-二硝基水杨酸(DNS)溶液
准确称取DNS6.3g于500mL大烧杯中,用少量蒸馏水溶解后,加入2mol/LNaOH溶液262mL,再加到500mL含有185g酒石酸钾钠(C4H4O6KNa•4H2O,MW=282.22)的热水溶液中,再加5g结晶酚(C6H5OH,MW=94.11)和5g无水亚硫酸钠(Na2SO3,MW=126.04),搅拌溶解,冷却后移入1000mL容量瓶中用蒸馏水定容至1000mL,充分混匀。
贮于棕色瓶中,室温放置一周后使用[4]。
2.1.3.20.1mol/L乙酸(CH3COOH)溶液
吸取冰乙酸0.6mL,加水溶解,定容至100ml[5]。
2.1.3.30.1mol/L乙酸钠(CH3COONa)溶液
称取无水乙酸钠1.36g,加水溶解,定容至100ml[5]。
2.1.3.40.1mol/L,pH为5.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液
称取无水乙酸钠11.57g,加入冰乙酸0.85ml,再加水溶解,定容至1000ml。
测定溶液的pH,如果pH偏离5.5,再用乙酸溶液或乙酸钠溶液调节至5.5[5]。
2.1.3.51mg/mL的木糖标准液
将木糖(D-木糖,C5H10O5MW=150.3,上海惠世生化试剂有限公司)在恒温干燥箱中105℃下干燥至恒重,准确称取100mg于100mL小烧杯中,用少量乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH5.5)溶解并定容至100mL,充分混匀。
4℃冰箱中保存(可用12~15天)[6]。
2.1.3.61%木聚糖标准溶液
精确称取1g木聚糖(Xylanfrombeechwood,Sigma)于100mL小烧杯中,加入乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH5.5),加热溶解后移入100mL容量瓶中并用乙酸-乙酸钠缓冲溶液定容至100mL,用前充分摇匀,4℃避光保存,有效期为3天[6]。
2.1.3.7pH标准缓冲液
将pH6.86的缓冲剂(混合磷酸盐,上海雷磁·创益仪器仪表有限公司)和pH4.00的缓冲剂(邻苯二甲酸氢钾,上海雷磁·创益仪器仪表有限公司)分别剪开塑料袋,将粉末倒入250ml容量瓶中,以少量无CO2蒸馏水冲洗塑料袋内壁,并稀释到刻度,摇匀备用[7]。
2.1.3.7不同pH的缓冲液配制
表2-1pH不同的缓冲液配制
Tab.2-1PreparationofthedifferentbufferinpH
pH
X
Y
pH
X
Y
4.0
7.71
12.29
6.0
12.63
7.37
4.4
8.82
11.18
6.4
13.85
6.15
4.8
9.86
10.14
6.8
15.45
4.55
5.2
10.72
9.28
7.2
17.39
2.61
5.6
11.60
8.40
0.2mol/L磷酸氢二钠溶液:
称取Na2HPO4·12H2O(分子量=358.14)71.63g溶解后,加水定容至1L。
0.1mol/L柠檬酸溶液:
称取C6H8O7·H2O(分子量=210.14)21.01g溶解后,加水定容至1L。
按表2-1比例混合:
Xml0.2mol/L磷酸氢二钠溶液+Yml0.1mol/L柠檬酸溶液。
将X和Y混合后,置于三角瓶中,用pH计校正(可用磷酸氢二钠溶液或柠檬酸溶液调节)[7]。
2.1.3.8不同pH的木糖标准溶液及木聚糖溶液配制
称取木糖0.02g,置于20mL具塞试管中,加入不同的pH缓冲液,溶解后,冷却并定容至20mL。
称取木聚糖0.1g,置于20mL具塞试管中,加入不同的pH缓冲液,加热溶解后,冷却并定容至10mL。
2.2方法
2.2.1木聚糖酶粗酶液制备
精确称取木耳菌糠,置于三角瓶中,加水100mL,并使三角瓶进行冰浴。
将超声波破碎仪探头插入三角瓶,距离底部1cm处,按特定参数进行超声破碎。
另称取一份,在105℃烘干4h,称重,计算干重与湿重比值。
超声结束后,于4℃、3000r/min离心15min,取上清液即为木聚糖酶粗酶液[7]。
2.2.2木聚糖酶活力测定方法
2.2.2.1木糖标准曲线的绘制
取8支洗净、烘干的20ml刻度试管,编号后按下表加入木糖标准溶液和蒸馏水,配制成一系列不同浓度的葡萄糖溶液,具体见表2-2。
表2-2木糖标准溶液的配制
Tab.2-2Thestandardxylosesolutionpreparation
试 剂
管 号
1
2
3
4
5
6
7
8
标准木糖溶液(ml)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
蒸馏水(ml)
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
木糖含量(mg)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
将溶液摇匀后,向各试管中加入1.5ml3,5-二硝基水杨酸,摇匀后在沸水浴中加热5min,取出冷却后用蒸馏水定容至刻度(要充分摇匀)。
在波长540nm处以1号试管溶液作为空白对照,调零点,测出其它各试管溶液的吸光度并记录结果。
以木糖糖含量为横坐标、对应的吸光度为纵坐标,绘制标准曲线[8]。
2.2.2.2木聚糖酶活力测定
取4支洗净烘干的20mL具塞刻度试管,编号后各加入1.5mL1%木聚糖溶液,并向1号试管中加入1.5mLDNS溶液以钝化酶活性,作为空白对照,比色时调零用。
将4支试管同时在50℃水浴中预热10min,再各加入酶液0.5mL(预热10min),50℃水浴中保温60min后取出,立即向2、3、4号试管中各加入1.5mLDNS溶液以终止酶反应,充分摇匀后沸水浴5min,取出冷却后用蒸馏水定容至20mL,充分混匀。
以1号试管溶液为空白对照调零点,在540nm波长下测定2、3、4号试管液的吸光值并记录结果。
酶活定义:
1g木耳菌糠(干重)在50℃、pH5.5条件下,每分钟由水解木聚糖生成1μmol木糖所需的酶量定义为一个酶活力单位,以IU/g表示。
木聚糖酶活力(IU/g)=
木糖含量(mg)×酶液定容总体积(mL)×6.66
反应液中酶液加入量(mL)×样品干重(g)×时间(min)
式中:
6.66为1mg木糖的μmol数。
(1000/150.13=6.66)[9]
2.2.3单因素试验
2.2.3.1振幅(功率)对提取木聚糖酶的影响
准确称取木耳菌糠5份,超声波破碎的振幅分别设置为60%、70%、80%、90%、100%,固液比为1:
40,超声时间为15s,总时间为15min,间歇时间为5s。
破碎结束后,离心取上清液,并进行木聚糖酶活力测定,得出适宜振幅。
2.2.3.2总时间对提取木聚糖酶的影响
准确称取木耳菌糠5份,超声波破碎的振幅设置为2.2.3.1中的最佳振幅,固液比为1:
10,超声时间为15s,总时间分别为5、10、15、20、25min,间歇时间为5s。
破碎结束后,离心取上清液,并进行木聚糖酶活力测定,得出适宜总时间。
2.2.3.3超声时间对提取木聚糖酶的影响
准确称取木耳菌糠5份,超声波破碎的振幅设置为2.2.3.1中的最佳振幅,固液比为1:
10,超声时间分别为5、10、15、20、25s,总时间为2.2.3.2得出的最佳时间,间歇时间为5s。
破碎结束后,离心取上清液,并进行木聚糖酶活力测定,得出适宜超声时间。
2.2.3.4固液比对提取木聚糖酶的影响
准确称取木耳菌糠5份,超声波破碎的振幅设置为2.2.3.1中的最佳振幅,固液比分别为1:
5、1:
10、1:
15、1:
20、1:
25,超声时间分别为2.2.3.3得出的最佳时间,总时间为2.2.3.2得出的最佳时间,间歇时间为5s。
破碎结束后,离心取上清液,并进行木聚糖酶活力测定,得出适宜超声时间。
2.2.4正交试验设计
在单因素试验的基础上,进行4因素(温度、时间、固液比)3水平正交试验,研究提取木耳菌糠中木聚糖酶的最佳工艺条件[10]。
表2-3L9(34)正交表
Tab.2-3L9(34)orthogonaltable
试验号
A
B
C
D
1
1
1
1
1
2
1
2
2
2
3
1
3
3
3
4
2
1
2
3
5
2
2
3
1
6
2
3
1
2
7
3
1
3
2
8
3
2
1
3
9
3
3
2
1
2.3作图及数据统计分析
作图及标准曲线拟合方程采用MicrosoftExcel;试验数据采用DPS(DataProcessingSystem)3.01专业版进行方差分析,用LSD法进行显著性测验[11]。
3结果与分析
3.1单因素试验结果
3.1.1振幅对提取木聚糖酶的影响
图1 振幅对提取木聚糖酶的影响
Fig.1Theaffectofamplitudetoextractxylanase
由图1可见,振幅在60%~80%时,随着振幅增大,超声波对细胞壁的破坏作用增强,胞内酶溶出速率增大,溶液中酶含量增大;振幅在80%~100%时,随着振幅增大酶的含量下降。
其主要原因是当振幅大于80%时,超声作用进一步加强了提取液的流动,从而减少了物料在超声场中的停留时间破壁作用也随之减弱[12]。
因此较适宜的振幅为80%。
3.1.2总时间对提取木聚糖酶的影响
图2 总时间对提取木聚糖酶的影响
Fig.2Theaffectoftotaltimetoextractxylanase
由图2可知随着时间的增加,提取出的木聚糖酶越多。
因为超声波破碎细胞结构使细胞内的酶释放出来,所以当时间增多,破碎效果好,释放酶就多,但是当继续延长时间时木聚糖酶的活力增加趋于平缓,这说明超声总时间对酶的提取量有着比较明显的影响,时间过短,酶的释放不充分,时间过长又起不到明显的增强作用,反而会浪费很多能量[13]。
因此超声总时间选择20min为最佳。
3.1.3超声时间对提取木聚糖酶的影响
图3 超声对提取木聚糖酶的影响
Fig.3TheaffectofUltrasonictoextractxylanase
由分析图3可以看出,超声时间为10s时为最佳。
在超声总时间一定的条件下,在5~10s时物料在超声场中的停留时间逐渐增大,对细胞的破坏越明显,释放出的酶越多。
但在大于10s时,酶的活力降低,由于酶在超声波场中停留时间过长,可能在超声波的空化作用[13]下,产生的瞬间高温高压,导致酶的结构变化甚至被分解而使酶逐渐失活,所以活力降低。
因此,最佳超声时间为15s。
3.1.4固液比对提取木聚糖酶的影响
图4 固液比对提取木聚糖酶的影响
Fig.4Theaffectofliquid-solidratiotoextractxylanase
由图4可以看出,不同的固液比对酶的提取有显著影响。
随着固液比的增大,酶的活力越大。
原因是提取液体积越大,接触越充分。
在相同时间内溶解出更多的酶。
但如果固液比过大,会消耗更多的的时间和能量同时也会增加超声波破碎细胞的阻力,使细胞破碎程度下降,从而降低有效成分的得率[14]。
因此固液比为1:
20为宜。
3.2正交试验结果与分析
表3-1木聚糖酶提取正交试验方案及结果分析
Tab.3-1Xylanaseextractionprogramandtheresultsoforthogonaltest
试验号
振幅
(%)
总时间
(min)
超声时间
(s)
固液比
木聚糖酶活力(IU/g)
1
60
15
10
1:
15
2.22
2.38
2.31
2
60
20
15
1:
20
2.65
2.74
2.84
3
60
25
20
1:
25
3.40
3.49
3.78
4
70
15
15
1:
25
3.48
3.42
3.22
5
70
20
20
1:
15
2.73
2.71
2.69
6
70
25
10
1:
20
3.34
3.40
3.22
7
80
15
20
1:
20
1.34
1.34
1.34
8
80
20
10
1:
25
4.07
4.20
4.42
9
80
25
15
1:
15
3.14
3.07
2.92
K1
2.87
2.34
3.28
2.69
K2
3.13
3.23
3.05
2.47
K3
2.87
3.31
2.54
3.72
R
0.26
0.97
0.74
1.25
由正交分析表可知,极差:
R固液比>R总时间>R超声时间>R振幅,所以固液比对木聚糖酶的提取的影响最显著,超声总时间的影响次之,超声时间的影响较弱,振幅的影响最弱。
表3-2木聚糖酶提取正交试验方差分析
Tab.3-1Xylanaseextractorthogonalanalysisofvariance
变异来源
平方和
自由度
均方
F值
显著水平
振幅
0.4214
2
0.2107
15.03012
0.00015
总时间
5.19882
2
2.59941
185.427
0.00000
超声时间
2.64702
2
1.32351
94.41162
0.00000
固液比
8.05669
2
4.02834
287.3588
0.00000
误差
0.25233
18
0.01402
总和
16.57626
由正交方差分析可知:
振幅、总时间、超声时间、固液比的显著水平分析均小于0.01,所以它们对木聚糖酶的提取量均有极显著影响。
表3-3木聚糖酶提取试验显著性分析
Tab.3-3Extractionofxylanasesignificanceanalysis
试验号
木聚糖酶平均活力(IU/g)
显著性分析
0.05
0.01
8
4.23
a
A
3
3.56
b
B
4
3.37
bc
B
6
3.32
c
BC
9
3.04
d
C
2
2.74
e
D
5
2.71
e
D
1
2.30
f
E
7
1.34
g
F
经显著性分析,8号试验的木聚糖酶活最高,因为其在显著性分析中,在0.01水平上与其它各组实验均存在显著地差异性,且其平均酶活最大。
表明8号试验工艺为木耳菌糠木聚糖酶提取的最佳工艺,即:
振幅为80%;总时间为20min;超声时间为15s;固液比为1:
25。
3.3提取次数
图5 提取次数
Fig.5Extractiontimes
由图5知,在相同条件下,提取次数越多,酶浸提越完全。
但随着提取次数的增多酶液的体积也增大,增加了后续处理的难度,所以提取次数不宜过多。
此外,提取次数增多对能量的消耗也越多[15]。
因此本实验中以4次为最佳提取次数。
3.4木聚糖酶酶学性质
3.3.1pH对木聚糖酶活力的影响
图6 pH对木聚糖酶活力的影响
Fig.6TheaffectofpHtoxylanaseactivity
由图6可知,在pH=4.8时为最佳。
当超出这一范围时酶活力高低变化不稳,其原因是:
一方面,可能与pH对酶蛋白活性部位中质子移变基团离子化状态的影响有关。
酶活性部位中质子移变基团可能参与保持活性部位正确的构象,酶与底物的结合和底物转变成产物。
在较高或较低
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- 论文 纤维素酶 提取