蚌埠学院酪氨酸酶的提取.docx
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蚌埠学院酪氨酸酶的提取
苹果中酪氨酸酶的提取及其催化活性研究
一、实验原理:
生物酶是一种生物催化剂,按照它的组成,可分为两类,一类是简单蛋白质,其活性取决于它的结构,如脲酶、淀粉酶等;第二类的结合蛋白质酶,它需要加入某些非蛋白质组分(称为辅助因子)后,才能表现出酶的活性。
酶蛋白质与辅助因子结合形成的复合物称为全酶。
例如酪氨酸酶是以铜离子为辅助因子的全酶。
通常反被酶作用的物质称为该酶的底物,一种酶催化特定的一个或一类底物的反应,具有很高的选择性和灵敏度,因而引起广大分析工作者的重视和兴趣。
酶已作为一种分析试剂得到应用。
特别是有生化、医学方面有很高的应用价值。
本实验从苹果中提取酪氨酸酶,并测定其催化活性。
当土豆、苹果、香焦等的受损面接触空气后会产生深棕色的现象是人们都见过的,这是这类物质含有酪氨酸和酪氨酸酶,酶存在于物质内部,当暴露在空气中后,在氧气的参与下,会发生一系列反应。
以下是主要的反应过程。
由于多巴转变成多巴红的反应速率较快,再转到下一步产物速率则慢得多,故可选择多巴转变为多巴红的反应速率的测定来判断催化反应的活性。
因多巴红具有特殊的颜色,故可用分光光度法测定,在不同的时刻测定某特定波长下的吸光度,用吸光度对时间作图,从所得的直线斜率求酶的活性。
酶的活性计算方法:
一般定义在优化的条件下(包括pH值、离子强度、温度等),25℃时在1min内转化1mol底物所需要催化剂的量为活性单位。
酶的活性计算公式:
式中:
a:
为所用溶液的酶的活性,
△A:
为最大吸收波长吸光度的变化,
T:
为时间(min),
K:
为多巴红的摩尔吸收系数,
V:
为加入酶的体积,
进而计算出原料(土豆)中酶的活性:
。
式中:
A:
为原料中酶的活性(注意此处A不是吸光度A),
V0:
为原料所得的酶溶液的总体积,
m:
为原料总质量。
二、实验目的
1、认识生物体中酶的存在和催化作用,了解生物体系中酶促反应的特点与有机合成的不同和相同之处,认识一些生物化学过程的特殊性。
2、掌握生物活性物质的提取和保存方法,学会使用仪器分析的手段研究催化反应,特别是生物化学体系中催化过程的基本思路和方法。
三、仪器和试剂
1、仪器:
分光光度计(含比色皿)、离心机、天平、豆浆机、容量瓶、秒表、烧杯、胶头滴管、玻璃棒。
2、试剂:
酪氨酸、磷酸二氢钾、氢氧化钠、盐酸、新鲜苹果(或土豆)、去离子水。
四、实验步骤
1、溶液配制
1.1酪氨酸溶液的配制
酪氨酸在中性水溶液中溶解度较小,因而配制过程中需加入一定量盐酸溶解。
首先称取一定量的酪氨酸配制0.1mol/L酪氨酸储备液,在实验过程中稀释至0.02mol/L,使用时需要加入一定量的NaOH调节其pH接近中性。
1.2缓冲溶液的配置
0.2mol/LKH2PO4:
称取2.7219gKH2PO4,去离子水溶解,转移至100ml容量瓶中,定容,摇匀,既可;
0.2mol/LNaOH:
称取0.8009gNaOH,去离子水溶解,转移至100ml容量瓶中,定容,摇匀,既可。
以一定的体积比配置pH=6.0和pH=7.2的KH2PO4-NaOH缓冲溶液。
体积比如下表:
表1.1KH2PO4-NaOH缓冲溶液的体积比
pH
KH2PO4与NaOH的体积比
6.0
5∶0.570
7.2
5:
3.500
2、酶的提取
取新鲜苹果,清洁后切碎,称取20.0g置于豆浆机中,加入7.5mLpH=7.2的磷酸缓冲溶液,打开电源,收集滤出提取液,立即高心分离5min,倾出上层清液保存于冰箱中,提取液为棕色,在放置过程中不断变黑。
3、酪氨酸最大吸收波长确定
取2.5mL酶提取液用pH=7.2的缓冲溶液稀释至10mL比色管中,摇匀。
取0.4mL已稀释过的土豆提取液,加2.6mLpH=6.0的缓冲溶液,加入2.0mL酪氨酸溶液,摇匀。
反应约数分钟后,于分光光度计上扫描绘制酪氨酸的吸收光谱图。
表1.2最大吸收波长的确定
波长(nm)
430
440
450
460
470
480
485
490
500
510
520
吸光度
0.460
0.496
0.530
0.540
0.560
0.575
0.585
0.576
0.569
0.551
0.515
吸收光谱的绘制如下:
图1.1酪氨酸吸收光谱的绘制
由图1.1可知酪氨酸的最大吸收波长为485nm。
4、酶活性测量
分别取0.4mL稀释过的提取液于10mL比色管中,加入5.0mLpH=6.0的缓冲溶液,再加入4.0mL酪氨酸溶液,同时开始计时,用分光光度计在450nm处测定吸光度。
开始6min内每分钟读一个数,以后隔2min读一个数,直至吸光度变化不大为止。
以吸光度对时间作图,从直线斜率求出酶的活性。
表1.3酶活性随时间的变化测试
时间/min
1
2
3
4
5
6
7
吸光度
0.146
0.154
0.156
0.159
0.164
0.166
0.17
时间/min
8
10
12
14
16
18
20
吸光度
0.172
0.18
0.186
0.191
0.198
0.205
0.206
时间/min
22
24
26
28
30
32
34
吸光度
0.206
0.206
0.205
0.206
0.204
0.206
0.206
5、酶活性因素测量
影响酶的活性的因素研究
(1)酸度条件试验:
取0.40mL稀释过的提取液,调节溶液至不同的pH值,考察pH对催化活性的影响。
(2)抑制剂的影响:
取0.40mL稀释过的提取液,加硫代硫酸钠、或EDTA或铜试剂等试剂,考察各试剂对催化活性的抑制作用。
同时同批作一个未加抑制剂的作为对照试验。
(3)温度条件试验:
取0.40mL稀释过的提取液在不同的温度条件下进行操作,考察温度对催化活性的影响。
(4)酶浓度的影响:
分别取不同含量(0.2、0.3、0.4、0.5和0.6ml)的提取液,测试不同酶含量对酶催化的影响。
(5)底物含量的影响:
分别取不同含量(1.0、1.5、2.0、2.5和3.0ml)的L-络氨酸体积,测试不同酶含量对酶催化的影响。
五、数据记录及结果讨论
1、绘制酶加入量的动力学曲线:
以吸光度为纵坐标,时间为横坐标,可得出在加入酶的作用下,酪氨酸转换的动力学过程,再由直线部分得出转换速率,即可计算酶的活性。
图1.2酶活性的测量
由直线斜率求出酶的活性:
提取液酶活性(α/(min•mL))
原料酶活性(A/(min•g))
3.33×108
3.33×108
2、影响酶的活性的因素研究:
(1)酸度条件试验:
取0.40mL稀释过的提取液,调节溶液至不同的pH值,考察pH对催化活性的影响。
pH
3.0
6.0
7.2
8.2
吸光度A
0.343
0.473
0.539
0.525
图1.3pH值对酶活性的影响
由图1.3可知,在pH=2或10时,溶液吸光值基本不变,这说明酶在此环境下已经失去活性,而丧失其催化效果。
(2)抑制剂EDTA对酶活性的影响:
取0.40mL稀释过的提取液,加EDTA试剂,考察各试剂对催化活性的抑制作用。
同时同批作一个未加抑制剂的作为对照试验。
EDTA体积/ml
0
1.00
2.00
3.00
吸光度A
0.427
0.397
0.423
0.432
图1.4EDTA对酶活性影响
由图1.4可知,当加入EDTA后,吸光度明显下降;当EDTA的浓度体积大于1ml时,吸光度有逐渐上升。
(3)温度对酶活性的影响:
取0.40mL稀释过的提取液在不同的温度条件下进行操作,考察温度对催化活性的影响。
温度(T/℃)
40
50
60
吸光度A
0.346
0.260
0.227
图1.5温度对酶活性的影响
由图1.5可知,温度不同时,酶的反应活性也不同,说明酶参与反应时有一个最适当温度。
(4)酶浓度对酶活性的影响:
分别取不同含量(0.2、0.3、0.4、0.5和0.6ml)的提取液,测试不同酶含量对酶催化的影响。
提取液体积/ml
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
吸光度A
0.196
0.267
0.402
0.606
0.609
图1.6酶含量对没催化效果的影响
由1.6可知,当溶液中酶的含量增加时,曲线斜率也增加,这表明酶浓度高,其反应活性也高;但当酶含量增加到一定程度,即过量时,吸光度不随提取液体积变化,说明底物在前一阶段是过量的。
(5)底物含量对酶活性的影响:
分别取不同含量(1.0、1.5、2.0、2.5和3.0ml)的L-络氨酸体积,测试不同酶含量对酶催化的影响。
L-络氨酸体积/ml
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
吸光度A
0.339
0.358
0.458
0.596
0.615
图1.7底物含量对酶催化效果的影响
由图可知,当底物的量较少时,吸光度较小,说明由络氨酸转变为的多巴红的量不多;随着底物的增加,吸光度增加,产生的多巴红增加,并且增加速度放缓。
六、思考题
1、影响酶活性的因素有哪些?
答:
酶是一种活性蛋白质。
因此,一切对蛋白质活性有影响的因素都影响酶的活性。
酶与底物作用的活性,受温度、pH值、酶液浓度、底物浓度、酶的激活剂或抑制剂等许多因素的影响。
2、提取物在放置过程中为何会变黑?
答:
它们的组织中都含有酪氨酸和酪氨酸酶,酶存在于物质内部,当内部物质暴露于空气中,在氧的参与下将发生反应,生成黑色素。
3、热处理后酶的活性为何会显著降低?
答:
酶的催化作用,只有在一定温度下才能表现出来。
酶的作用速度与温度的关系为:
当酶蛋白没有因受热而变性时,温度每升高10℃,反应速度增加一倍左右。
通常酶的作用速度随温度升高而加速,但温度升高到一定限度后,酶的活性就要钝化,直至完全失活。
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