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细胞工程讲义
绪论
第一节细胞工程在生物技术领域中的地位
生物工程
1生物工程的定义
生物工程也称生物技术或生物工艺,具有悠久的历史,几乎与人类文明的发展史一样源远流长。
生物工程是以生命科学为基础,利用生物体系和工程学原理生产生物制品和创造新物种的一门综合技术。
换言之,就是利用生物有机体(从微生物直至高等动物)或其组成部分(器官、组织、细胞等)发展新工艺或制造新产品的一种科学技术。
2生物工程的发展历程
1)第一代生物工程:
1680年列文虎克制造显微镜,人们才观察到微生物的存在;1857年,巴斯德证实酒精发酵是由活酵母引起的。
2)近代生物工程:
1928年英国人弗来明发现了青霉素,1940年弗罗里和钱恩提取了高效的青霉素,但大规模制备却非常困难。
1943年,美国和英国联合开发了大量制备青霉素的工艺。
3)现代生物工程:
1953年,沃森和克里克发现了DNA的双螺旋结构;1974年,美国的波依耳和科恩实现了基因的转移;20世纪70年代后,生物工程进入了新的发展阶段――现代生物工程阶段。
这期间的现代生物技术及其产品的特点是运用了DNA重组、细胞融合等技术的成果。
3现代生物工程的特点与组成
发酵工程、酶工程、蛋白质工程、基因工程、生物化学工程、细胞工程
发酵工程:
利用微生物的特定性状,通过现代工程技术,在生物反应器中生产有用物质的一种技术。
酶工程:
利用酶的催化作用,采用适当的生物反应器工业化地生产人类所需的产品或是达到某一特别目的的一门生物工程技术。
蛋白质工程:
利用生物技术手段对蛋白质的DNA编码序列进行有目的的改造并分离、纯化蛋白质,从而获取自然界没有的、具有优良性质或适用于工业生产条件的全新蛋白质的技术。
基因工程:
根据人们的意愿对不同生物的遗传基因进行切割、拼接或重新组合,再转入生物体内生产出人们所期望的产物,或创造出具有新遗传性状的生物类型的一门技术。
生物化学工程:
是由生物科学与化学工程相结合的交叉学科,主要研究将生物技术的实验室研究成果转化为生产力过程中的带有共性的工程技术问题,是生物技术的一个重要组成部分。
细胞工程
1细胞工程的定义
细胞工程(cellengineering)是应用细胞生物学和分子生物学方法,通过类似于工程学的步骤,在细胞整体水平或细胞器水平上,按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质以获得新型生物或特种细胞产品的一门综合性科学技术。
研究对象:
染色体,细胞核,原生质体,整个细胞,受精卵,胚胎,组织或器官等。
根据研究对象不同,高等生物的细胞工程可分为动物细胞工程和植物细胞工程。
动物细胞工程包括细胞培养技术(组织培养、器官培养),细胞融合技术,胚胎工程技术(核移植、胚胎分割等技术),克隆技术(单细胞系克隆、器官克隆核个体克隆)。
植物细胞工程包括植物组织、器官培养技术,细胞培养技术,原生质体融合与培养技术,亚细胞水平的操作技术等。
2细胞工程的主要研究内容
1)动植物细胞与组织培养:
细胞培养、组织培养和器官培养。
2)细胞融合:
细胞融合最大的贡献是在动植物、微生物新品种的培育方面。
3)染色体工程:
最大的价值体现在新品种的培育,主要是单倍体与多倍体育种方面。
4)胚胎工程:
最成功的应用领域体现在畜牧业。
5)细胞遗传工程:
主要包括克隆和转基因技术。
该技术可以说代表了现代细胞工程,甚至是整个生物工程的前沿领域。
3细胞工程的重要应用
优质植物快速培育与繁殖
动物胚胎工程快速繁殖优良、濒危品种
利用动植物细胞培养生产活性产物、药品
新型动植物品种的培育
供医学器官修复或移植的组织工程
转基因动植物的生物反应器工程
珍稀动植物资源的保存与保护
在遗传学、发育学等领域的理论研究
在能源、环境保护等领域的应用
4细胞工程与其他生物工程的关系
1、细胞工程学科的建立依赖于相关学科理论的发展
细胞生物学、分子生物学、生物化学、遗传学、微生物学、动物学、植物学
2、细胞工程为生物学研究提供新的实验体系
3、细胞工程必须与其它生物技术相结合才能更好地发挥作用
第二节植物细胞工程的发展
(一)植物细胞工程的发展
植物细胞工程的定义:
以植物组织细胞为基本单位,在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精细操作,使细胞的某些生物学特性按人们的意愿发生改变,从而改良品种或创造新物种,或加速繁殖植物个体,或获得有用物质的过程。
1探索阶段
1)细胞学说和细胞全能性学说的提出。
2)1904年,Hanning进行萝卜和辣根菜的胚培养时,发现离体胚可以充分发育,并且提前萌发形成小苗,这是世界上胚胎培养最早获得成功的一例。
2培养技术建立阶段
1)20世纪30年代开始至50年代末期,建立了两个与培养技术有关的重要模式:
培养基模式;激素调控模式。
2)1937年,White建立了植物根的离体培养技术,并产生了White培养基。
3)Gautheret于1939年在添加B族维生素和IAA的培养基上连续培养胡萝卜根的形成层获得首例成功。
4)1938年,Nobecourt以胡萝卜根为外植体,在固体培养基上培养诱导形成了愈伤组织。
White、Gautheret和Nobecourt一起被誉为植物组织培养的奠基人。
5)Skoog和Miller等分别提出了激素调控器官形成的概念。
6)Reinert(1959)、Steward和Shantz(1959)分别报道,在胡萝卜愈伤组织培养中形成了体细胞胚。
至此,植物组织培养技术已基本建立起来。
3应用研究阶段
1)1952年,Morel和Martin首次证实,可以从已受病毒侵染的大丽花中获得无毒植株。
2)1964年,Guha和Maheshwari采用曼陀罗花药培养首次获得成功。
3)1971年,Takebe等在烟草上首次由原生质体获得了再生植株。
4)1972年,Carlson等通过两个烟草种间原生质体的融合,获得了第一个体细胞杂种。
该阶段的发展特点:
1)组织培养领域的研究迅速在世界各国的有关实验室广泛展开。
2)技术体系更加完善。
3)形成了较为完整的理论体系。
4)研究目的性更加明确。
(二)我国植物细胞工程的研究进展
1)我国植物细胞工程领域的研究起步于20世纪70年代初。
2)我国花药培养和单倍体育种研究处于国际前列,这一领域的主要成就体现在培养基的改进和单倍体的应用中。
3)我国从20世纪70年代开始引进和推广植物脱毒和繁殖技术,1981-1985年期间建立了马铃薯和甘蔗的脱毒试管苗生产技术体系,并应用于种苗生产。
4)到20世纪90年代中期,全世界大约有180种植物的原生质体培养再生植株获得成功,其中约50种由我国首次报道,包括许多重要农作物如棉花、大豆、蚕豆、花生、高粱和玉米等。
第三节动物细胞工程的发展
动物细胞工程:
是根据细胞生物学及工程学原理,定向改变动物细胞内的遗传物质从而获得新型生物或特种细胞产品的一门技术。
细胞工程的历史相当悠久。
以细胞融合为例,1838年马勒在脊椎动物肿瘤细胞中观察到了多核现象;1849年罗宾也发现了多核现象;1855-1858年,更多的科学家发现了多核现象的存在。
在动物学界,1907年美国生物学家哈里森利用盖玻璃片悬滴培养蛙胚神经组织,存活数周,并观察到细胞生长现象,开创了动物细胞培养的先河;1965年哈里斯和沃特金斯证明了灭活的病毒在控制的条件下可以用来诱导动物细胞的融合。
细胞工程近年来获得了令人瞩目的迅速发展,其中最具有代表性的成就有:
1977年英国采用胚胎工程技术成功培育出世界首例试管婴儿;1997年英国利用成年动物体细胞克隆出绵羊“多莉”;2001年英国又宣布成功培育出世界首批转基因克隆猪。
我国在细胞工程一些领域的研究已经进入世界先进行列。
如:
转基因鱼、试管婴儿、动物体细胞克隆等。
第四节细胞工程基础
(一)细胞生物学基础
1细胞
1665年,英国人罗伯特·胡克用自己制造的显微镜观察软木片,发现有许多状如蜂窝的小孔,他便称之为细胞。
现在认为,他看到的仅仅是死亡细胞的细胞壁。
此后,许多学者在不同的生物体中都看到过细胞。
1831年,罗伯特·布朗从兰科植物的叶片表皮细胞中发现了细胞核。
1835年,在低等动物根足和多孔虫的细胞中发现了细胞内含物――细胞质。
细胞一般都是很小的,大多数细胞的直径是10~100μm,用低倍显微镜就能看到。
有的细胞直径只有0.1μm,需用高倍显微镜才能看到。
细胞的形状多种多样,有球形、多面体、纺锤体和柱状体等。
细胞的性状和功能之间有密切关系。
氧、碳、氢、氮、磷、硫6种元素是组成原生质的主要元素,在原生质中所占比例分别是65%、18%、10%、3%、1.4%和0.3%。
此外,钙、钠、钾、氯、镁、铁、铜、锌、硼、钼等无机元素也是生命所不可缺少的。
细胞中无机盐的含量约占其干重的2%~5%,它们在细胞中通常以离子的形式存在。
构成细胞的有机物一般指含碳化合物或碳氧化合物及其衍生物的总称。
2染色质与染色体
1879年,弗来明提出了染色质的术语,用以描述染色后细胞核中强烈着色的细线状物质。
染色质:
细胞分裂间期细胞内由DNA、组蛋白、非组蛋白及少量RNA组成的线性复合结构,是间期细胞遗传物质的存在形式。
染色体:
细胞有丝分裂或减数分裂过程中,由染色质聚成的棒状结构。
3细胞周期S期、G1期、G2期、M期
4细胞分裂细胞分裂的方式有三种:
无丝、有丝和减数分裂。
1)无丝分裂:
是一种最简单的细胞分裂方式,只出现在低等生物或动植物的器官和组织内,大多以横裂或纵裂的方式由一个细胞变成两个细胞。
2)有丝分裂:
是细胞分裂的主要形式,其实质是染色体经过复制变成双份,再平均分配到两个子细胞中去,从而保持遗传物质的稳定传递。
间期;前期;中期;后期;末期
3)减数分裂:
是生殖细胞成熟时特有的分裂方式,在染色质复制一次后,要经过两次分裂,结果子细胞的染色体数目比亲代细胞减少了一半。
5细胞分化与细胞全能性
细胞分化:
个体细胞发育过程中,后代细胞在形态、结构和生理功能上发生差异的过程成为细胞分化,这种差别一般与细胞的功能相适应。
细胞全能性:
细胞具有发育成完整个体的潜能。
去分化:
通常情况下,分化细胞的表型要保持稳定,以执行特定的功能。
然而在某些条件下,分化细胞也不稳定,其基因活动模式会发生可逆的变化,又回到未分化状态,这一过程成为去分化。
(二)分子生物学基础
1基因的概念与基因的复制
基因:
具有特定生理功能的染色体上包含遗传信息的一段DNA片断。
染色体的复制主要是通过DNA的半保留复制完成的,即以亲代DNA分子的单链为模板合成两条子代DNA链,最终成为两个拷贝,并分配到两个子细胞中去,从而完成DNA遗传信息载体的使命。
2转基因技术
基因工程即重组DNA技术,是指根据人们的意愿对不同生物的遗传基因进行切割、拼接或重新组合,再转入生物体内生产出人们所期望的产物,或创造出具有新遗传性状的生物类型的一门技术。
1972年诞生了世界上第一批重组DNA分子,次年几种不同来源的DNA分子装入载体后被转入到大肠杆菌中表达,标志着基因工程正式登上历史舞台。
基因工程产品制备一般包括以下四个步骤:
目的基因的获得
构建重组DNA
重组DNA引入细胞
表达目的基因的受体细胞的挑选
普通生物学基础
1组织、器官
植物组织可分为分生组织和永久组织两大类。
动物组织可分为四大类:
上皮组织、结缔组织、肌肉组织和神经组织。
2生殖、发育
1)无性生殖:
一切不涉及性别、没有配子参与、没有受精过程的生殖都属于无性生殖,包括:
裂殖、出芽、孢子生殖、再生作用。
2)有性生殖:
两个性细胞(即配子(精子或卵子))融合为一,成为合子或受精卵,再发育成为新一代个体,就是有性生殖。
3)高等植物的生殖和发育4)高等动物的生殖和发育5)遗传与育种
第一章实验室设置及常规技术
第一节实验室设置
任何一个实验室的建设均需考虑两个方面的问题:
一是所从事的实验的性质,即是生产性或研究性的,是基本层次的还是较高层次的;二是实验室的规模,规模主要取决于经费和实验性质。
(一)实验室组成
1基本实验室
基本实验室包括准备室、接种室和培养室,是细胞工程实验所必须具备的基本条件。
(1)准备室:
功能就是进行一切与实验有关的准备工作。
这些工作包括器皿的洗涤、培养基的配制与分装、培养基和器皿的灭菌、培养材料的预处理等。
要求宽敞明亮;地面便于清洁,并进行防滑处理;可设计成分体式或通体式。
(2)接种室:
功能是进行材料的离体无菌操作。
要求封闭性好,干燥清洁,能较长时间保持无菌;地面便于清洁;定期灭菌处理,保持良好的无菌环境。
(3)培养室:
功能是对离体材料进行控制条件下的培养要求能够控制光照和温度并保持相对的无菌环境
2辅助实验室
辅助实验室是根据研究或生产的需要而配套设置的专门实验室,主要用于细胞学观察和生理生化分析等。
(1)细胞学实验室:
功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究,由制片室和显微观察室组成。
制片室应安装通风橱,并有相应的废液处理设施;显微观察室要求房间清洁、明亮、干燥,防止潮湿和灰尘污染。
(2)生化分析实验室:
便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。
3实验室布局
实验室布局应在实验室建筑设计时确定,其基本要求是:
便于隔离、便于操作、便于灭菌和便于观察。
接种室、培养室应放在与外界环境隔离的区域,使之能较长时间保持无菌状态,从而免除频繁消毒的麻烦。
灭菌室应与接种室相邻,以便于将灭菌后的培养基及用品直接放置于接种室,尽可能免除再污染。
(二)基本设备配置
1常规设备
常规设备主要是用于试剂保存与称量、培养基配制与分装和水处理等,根据实际需要予以配置。
(1)天平:
2-3台不同精度的天平。
(2)冰箱:
配备冰箱1-2个,用于药品的贮藏和某些材料的低温处理。
(3)酸度计:
精度0.01即可。
(4)离心机:
低速离心机,高速冷冻离心机。
(5)加热器:
带磁力搅拌功能的加热器;大功率加热和电动搅拌系统。
(6)纯水器:
对于一般培养,可使用4级过滤的反渗透纯水器。
(7)分装设备:
用于培养基分装。
2灭菌设备
1、高压蒸汽灭菌锅:
常用的主要灭菌设备,一般用于培养基、玻璃器皿以及其它可高温灭菌用品的灭菌。
2、干热消毒柜:
用于一些金属工具如镊子、剪刀、解剖刀等的灭菌,也可用于玻璃器皿的灭菌,可选择温度200℃左右的普通或远红外消毒柜。
3、过滤灭菌装置:
用于一些酶制品、激素以及某些维生素等不能高温灭菌试剂的灭菌。
4、紫外灯:
方便、经济的控制无菌环境的装置,一般安装在细胞工程实验室的各个房间。
5、喷雾消毒器
3无菌操作设备
主要有净化工作台、接种箱等。
接种箱是较早使用的最简单的无菌装置,对接种室的无菌环境要求很高。
净化工作台是现在普遍使用的无菌操作设备。
4培养设备
培养设备是指根据需要所选用的不同规格和控制精度的用于植物细胞、组织或器官培养的设施和设备,包括培养架、培养箱、摇床、生物反应器等。
5其它设备
为保证光照、温度的准确控制,培养室需安装时间程序控制器、温度控制系统等,以控制光照时间和温度。
(三)培养容器与用具
培养容器是指盛有培养基并提供培养物生长空间的无菌器皿;培养用具是指培养物接种封口所用的各种金属或塑料制品,这是任何细胞工程实验室所必须具备的条件。
1培养容器
(1)玻璃容器:
一般情况下,各种玻璃容器均可用于植物材料的培养,特别是一些快速繁殖培养的类型,尽量选择无色并不产生颜色折射的玻璃容器。
通常使用的培养容器包括各种规格的培养皿、三角瓶和试管等,也可使用T-型管、角形瓶和L-型管等。
(2)塑料容器:
具有材质轻、不易破碎、制作方便等优点。
分为一次性使用的容器和可重复使用的容器。
2金属用具
细胞工程实验室的接种以及解剖工具,通常使用金属制品,一般多选用医疗器械的相应工具,如镊子、剪刀、解剖刀等。
(1)镊子:
小的尖头镊子适用于植物组织解剖;枪形镊子适于继代培养中的转管操作等。
(2)剪刀:
多用于植物材料的切段转移繁殖及部分材料的取材。
(3)解剖刀:
一般用于组织切段。
(4)其它工具:
包括接种铲、接种针等。
花药培养、花粉培养及愈伤组织操作时使用。
3塑料用具
塑料用具包括各类塑料封口膜、盖、塑料盘以及实验室使用的其它塑料用品。
第二节基本技术
(一)洗涤技术
1洗涤剂
分为合成洗涤剂和铬酸洗涤剂,后者需在实验室配制。
铬酸洗涤液使用重铬酸钾与硫酸配制而成,可根据需要配成弱、中、强三种浓度。
新配制的铬酸洗涤液呈棕红色,应贮存于防酸、耐热、开口较大的塑料或玻璃容器中。
仅用于玻璃试验器皿的洗涤,可反复使用,直至溶液呈青褐色为止。
2洗涤方法
(1)玻璃器皿洗涤:
1%的HCl溶液浸泡一昼夜,再用合成洗涤剂洗刷,然后用清水反复冲洗,最后用蒸馏水冲洗1-2次,干燥后即可使用。
(2)塑料用品洗涤:
一般用合成洗涤剂洗涤,冲洗时需反复多次,最后用蒸馏水冲洗。
(3)金属用品洗涤:
一般用酒精擦洗,并保持干燥。
(二)灭菌技术
灭菌是指杀灭培养物、培养基、培养用具及培养环境的杂菌,是防止微生物污染的最重要、最基本的环节,是植物细胞工程技术中首先必须注意的问题,一般有物理方法和化学方法两种。
物理方法是利用高温、射线等杀死微生物或通过过滤、离心沉淀等去除微生物。
化学方法是使用消毒剂、抗菌素杀灭微生物。
1培养基灭菌:
一般采用高压蒸汽灭菌或过滤灭菌。
培养基的灭菌时间和温度应严格控制,时间不足或低于灭菌温度可能造成灭菌不彻底而使培养基污染;时间过长或温度过高,则又可能产生许多不利影响,诸如引起培养基成分的分解或无机盐的沉淀,有时还会引起糖类物质的焦化而产生有毒物质等。
2玻璃器皿灭菌:
可任选湿热和干热灭菌方法灭菌,一般以25-30min为宜。
湿热灭菌后及时放入净化工作台干燥。
干热灭菌,即在烘箱中加热至160-180℃后恒温保持40min,或120℃灭菌2h。
玻璃器皿放入烘箱前必须完全干燥。
3金属用具灭菌:
使用前的灭菌可采用干热灭菌,使用过程中的灭菌通常是将其浸泡在70%的酒精中,再以火焰将酒精烧去。
4操作环境灭菌:
可通过气体熏蒸或紫外线照射。
第三节培养基组成及配制
(一)培养基成分
1无机盐类
根据植物对必需元素所需要的量,培养基的无机成分可分为大量元素和微量元素。
大量元素包括碳、氢、氧、氮、磷、钾、钠、钙、镁和硫,用量一般在每升几十至几千毫克。
微量元素有铁、铜、锌、硼、钼、锰和钴,用量一般低于10-5-10-7mol/L。
除C、H、O外,其它矿质元素以离子的形式提供相应的元素供培养物吸收。
2有机化合物
培养基中只含有无机盐类,常称之为基本培养基。
常用的有机成分主要包括糖类、维生素、醇类、嘌呤和氨基酸等。
(1)糖类:
既可作为C源,又可维持培养基的渗透压。
植物组织培养中常使用蔗糖,此外还有麦芽糖、葡萄糖、果糖、纤维二糖或甘露糖等。
(2)维生素:
直接参与生物催化剂-酶的形成,还参与植物蛋白质、脂肪的代谢等重要生命活动。
离体培养常用的维生素包括硫胺素、吡哆醇、烟酸、生物素、泛酸钙、叶酸、维生素C等。
(3)肌醇:
在糖类的相互转化、维生素和激素的利用等方面具有重要的促进作用,对胚状体和芽的形成有良好的影响。
(4)腺嘌呤:
外加腺嘌呤,具有促进细胞自身合成细胞分裂素的功能,有利于细胞的分裂和分化,促进芽的形成和生长。
(5)氨基酸(6)其它复合成分
3生长调节物质
生长调节物质包括天然植物激素和人工激素类似物。
(1)生长素类:
促进细胞分裂和生长,有利于外植体脱分化并启动细胞分裂,有利于形成愈伤组织。
同时,生长素与细胞分裂素的协调作用,对于培养物的形态建立也是十分重要的。
(2)细胞分裂素类:
促进细胞的分裂,调节器官分化,延迟组织衰老,增强蛋白质合成等,还能显著改善其它激素的作用。
(3)赤霉素类:
在离体培养条件下,赤霉素的主要作用是促进细胞的伸长生长,与生长素协调作用对形成层的分化具有一定影响,同时还能刺激体细胞胚进一步发育成植株。
4水占培养基成分的95%。
根据培养类型及其研究层次不同,可选择使用不同处理级别的水。
(二)培养基配方及培养基选择
1常用培养基配方
(1)高盐平衡培养基:
MS培养基、LS培养基、BL培养基、BM培养基和ER培养基。
特点:
无机盐浓度较高,元素间的比例适当,离子平衡性好,具有较强的缓冲性;营养丰富;微量元素种类全,浓度高。
(2)高硝态氮培养基:
B5培养基,N6培养基及SH培养基等。
特点:
硝酸钾的含量高,氨态氮的含量低,含有较高的盐酸硫胺素。
(3)中盐培养基:
H培养基、Nitsch培养基、Miller培养基和Blaydes培养基。
特点:
大量元素无机盐约为MS的一般,微量元素种类减少而含量增高,维生素种类比MS多。
(4)低盐培养基:
White培养基、WS培养基、HE培养基、改良Nitsch培养基及HB培养基等。
特点:
无机盐含量低,有机成分含量相对也很低。
2培养基筛选
(三)培养基配制
1培养基母液配制
无机盐按大量元素、微量元素和铁盐3部分分别配制。
大量元素一般配制成(10-20)×母液,微量元素和铁盐则配制成(100-200)×母液。
有机成分最好单独配制。
配好的母液需贮存于2-4℃冰箱中。
植物激素使用的浓度很低,因此,一般分别配制成0.1-1mg/L浓度的溶液。
2培养基制备
制备培养基时是根据实际需要配制,首先按大量元素、微量元素、铁盐及有机成分的顺序,依次吸取各母液的需要量,加入一适当体积的烧杯或其它配制培养基的容器中,再加入适当体积的蒸馏水,并称取相应量的蔗糖放入其中溶解,调节pH值,加入琼脂,加热使其完全融化,最后用蒸馏水定容并分装。
第四节外植体接种培养
(一)植物材料的培养与外植体取材
外植体:
是指用于离体培养的活的植物组织、器官等材料,它是植物离体培养的基础材料。
1外植体的来源
1)生长在自然环境下的植物;2)有目的地培育在温室控制环境条件下生长地植物;3)无菌环境下已经过离体培养地植物。
2供体植株的管理
1)避免昆虫为害;2)注意防病;3)控制湿度。
(二)外植体灭菌
次氯酸盐一般用于一些较软和较幼嫩的组织消毒,消毒时间一般在5-30min之间。
氯化汞灭菌效果最好,一般用于种子、块根、块茎及较硬组织的灭菌,需控制好消毒时间,一般不超过10min,使用浓度为0.1%-0.2%。
1种子灭菌
自来水冲洗20min;然后用70%-75%的乙醇处理0.5-1min,再在烧杯中加入消毒剂,同时滴1-2滴吐温20,摇床或搅拌灭菌处理;弃去消毒液,无菌水冲洗5次;灭菌后的种子用无菌纸吸干水分备用。
2芽、叶片、茎等组织材料灭菌
3未成熟胚、子房及花药灭菌
(三)接种培养及其培养条件的控制
外植体灭菌后,立即置于无菌操作台上进入无菌操作程序。
1)工作人员进行必要的清洁和消毒。
2)根据外植体的类型和培养需要,对外植体进行分割。
分割时刀片和外植体成直角,并保证切口整齐。
分割后的外植体应立即接种,以防失水。
3)切口需与培养基充分接触。
4)在适当的条件下进行培养。
培养条件主要包括光照、温度、培养基pH和培养环境的空气流通程度等。
1)光照:
光照调节通常是分阶段进行。
初期:
散射光或弱光;后期:
增强光照。
光质对细胞分裂的影响似乎受一些培养基成分的控制。
2)温度:
植物组织培养常用的温度范围一般在20-30℃,低于15℃或高于35℃均会影响培养物的生长。
一般来讲,组织、器官的培养温度控制可粗放一些,而细胞、原生质体培养温度的控制则要精细。
3)培养基pH:
植物离体
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