刘耀光多靶点pCRISPR载体单子叶和双子叶植物用使用方法414new1.docx
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刘耀光多靶点pCRISPR载体单子叶和双子叶植物用使用方法414new1
CRISPR/Cas9-basedgenomeeditingtechnology
ArobustCRISPR/Cas9vectorsystemformultiplextargetingofgenomicsitesinmonocotanddicotplants
亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室
华南农业大学生命科学学院
刘耀光课题组
(**************.cn)
1.pYLCRISPR/Cas9多靶点载体介绍
CRISPR/Cas9是新近发展的基因组编辑技术(图1)。
CRISPR/Cas9切割靶序列仅需要single-guideRNA(sgRNA)以及由sgRNA引导的Cas9蛋白,比锌指核酸酶(ZFNs),TALENs更加简便,高效,因而成为基因组编辑工具的首选。
我们利用CRISPR/Cas9技术可方便地进行多重靶向的特征,构建了一套用于单子叶和双子叶植物的多靶点CRISPR/Cas9基因打靶载体系统。
本套载体将Cas9蛋白表达盒整合到双元载体上,用于装载多个sgRNA表达盒的多克隆位点BsaI位于靠近双元载体RB位置。
sgRNA表达盒元件设在中间质粒载体上,利用酶切连接和PCR方法拼装好,再利用GoldenGate或GibsonAssembly克隆方法组装到双元载体上。
Figure1.AworkingmodeloftheCRISPR/Cas9system.TheCas9-sgRNAcomplexlocatestothetargetsitetocleavetheDNAtoproducedoublestrandbreak(DSB).
2.CRISPR/Cas9载体与sgRNA载体图谱
2.1CRISPR/Cas9双元载体
本套载体系统的双元载体骨架为pCAMBIA-1300(ACCESSION:
AF234296),Cas9p为本实验室设计合成的植物优化密码子基因,它模拟了禾本科植物基因具有5’端GC含量较高的特征(Figure2)。
这些质粒在E.coliTOP10F’(LacIq)菌株繁殖,该菌株LacIq基因型产生的阻碍蛋白可抑制ccdB大肠杆菌致死基因的表达。
pYLCRISPR/Cas9Pubi-H,-B载体中的Cas9p用pUbi驱动,优选用于单子叶植物的基因打靶;对于双子叶植物,目前优先使用pYLCRISPR/Cas9P35S-H,-N,-B。
我们用pYLCRISPR/Cas9Pubi-H在拟南芥也打靶成功,但与pYLCRISPR/Cas9P35S-H对拟南芥的打靶效率比较正在测试中。
我们对pYLCRISPR/Cas9载体采用了新的命名,与旧的命名对应关系见表1。
Figure2.ACRISPR/Cas9systemformonocotanddicotplants.
pYLCRISPR/Cas9Pubi-H,-B(above);pYLCRISPR/Cas9P35S-H,-N,-B(below);HPT(-H),Bar(-B),andNPTII(-N)encodehygromycinBphosphotransferase,PPTacetyltransferaseandneomycinphosphotransferaseII,respectively.NLS,nuclearlocalizationsequence.ThekeysequencesincludingrestrictionsitesforcloningandanalysisofsgRNAexpressioncassettesaregiven.TwoBsaI-cuttingsties[BsaI(B-L)andBsaI(B-R)]forcloningthesgRNAexpressioncassettesareseparatedbyashortenformoftheccdBnegativeselectiongene.
表一pYLCRISPR/Cas9载体新旧命名对应关系
新命名
原命名
适用植物种
植物抗性
pYLCRISPR/Cas9Pubi-H
pYLCRISPR/Cas9-MH,
pYLCRISPR/Cas9-MTmono
单子叶/双子叶
潮霉素
pYLCRISPR/Cas9Pubi-B
pYLCRISPR/Cas9-MB
单子叶/双子叶
草甘磷
pYLCRISPR/Cas9P35S-H
pYLCRISPR/Cas9-DH
双子叶
潮霉素
pYLCRISPR/Cas9P35S-B
pYLCRISPR/Cas9-DB
双子叶
草甘磷
pYLCRISPR/Cas9P35S-N
pYLCRISPR/Cas9-DN
双子叶
卡那霉素
2.2CRISPR/sgRNAvectors
sgRNA序列全长96nt,分为两部分,5’决定靶序列的20碱基(seedsequence)和3’区域为保守的结构序列。
因此构建针对特定靶位点的sgRNA,只需要克隆决定靶序列的5’端20nt(seedsequence)。
sgRNA用smallnuclear(sn)RNAU6/U3启动子驱动,以保证转录出的sgRNA停留在细胞核中与Cas9结合。
本方案用PCR扩增的方法构建包含靶序列的sgRNA表达盒,并在扩增引物5’端引入顺次排列的位置特异BsaI酶切位点,用于GoldenGate克隆。
或在扩增引物5’端加入互补序列用于GibsonAssembly连接克隆。
为了提高构建好的多靶点载体的稳定性,避免在农杆菌或者植物基因组中sgRNA表达盒之间发生同源重组,从水稻克隆了4个不同snRNA启动子(OsU3,OsU6a,OsU6b,OsU6c),用于单子叶植物;从拟南芥中克隆了4个不同snRNA启动子(AtU3b,AtU3d,AtU6-1,AtU6-29),用于双子叶植物。
Figure3.(A)OverallstructureofeightbasicsgRNAintermediatevectors.(B)ThetwoBsaIcuttingsequencesaregivenintwelvesgRNAvectors(inalinearform),includingotherfourvectors(pYLsgRNA-OsU3/LacZ,pYLsgRNA-OsU6a/LacZ,pYLsgRNA-AtU3b/LacZ,andpYLsgRNA-AtU3d/LacZ)thathaveanadditionalLacZgene(198bp)asacloningselectionmarker.TheU3andU6promotersfromrice(Os)andArabidopsis(At)andthesgRNAsequenceareseparatedbythevectorbackbone,toavoidamplificationoftheuncutplasmidsbyPCRwithshortextensiontimeduringtheconstructionofsgRNAexpressioncassettes.Cutting(smallarrows)withBsaIproducesdifferentnon-palindromicstickyendstothepromotersandanendtothesgRNAsequence.(C)Arepresentativeregulartargetandanirregulartarget,theirtargetadaptorsfortheOsU6apromoter,andthetranscribed5’sequencesareshown.Aligatedtarget-sgRNAexpressioncassetteisamplifiedbynestedPCRusingprimersU-F/gR-RandPps/Pgs.PpsandPgsareposition-specificprimerswithBsaIsitesfortheGoldenGateligation(TableS1),orwithoverlappingendsforGibsonAssembly(TableS3).
3.靶位点选择和接头设计
3.1靶位点选择
建议对1个目的基因设计2个靶点(尤其只有一个靶基因),以降低某靶点打靶不成功的风险。
可在ORF5’区和功能结构域各设计1个靶点,使之任何1个靶点的突变都可以产生功能缺失,或2个靶点之间的序列被敲除。
设计靶点的原则:
(1)目的基因的正链和负链靶点的打靶效率大致相同,都可以设计靶点;
(2)Regulartargets&irregulartargets(见以下说明)有同等打靶效率;
(3)靶点的GC%尽量不要低于40%,靶点序列GC%偏高(50-75%)有较高的打靶效率。
靶点内(按5-N20NGG-3方向)不要有连续4个以上的T,以防RNAPolIII将其作为转录终止信号;
(4)虽然非特异打靶(脱靶)对植物基因打靶不是很重要的问题,但应进行靶点特异性分析:
用靶点+NGG(前后各加几十碱基)与基因组做blast(选Somewhatsimilarsequences),避免使用与同源序列差异少于5个碱基的靶点(在切点附近和PAM可有2个碱基差异就具有特异性)。
可以使用在线软件CRISPR-P(targets(AN19NGG或GN19NGG),见以下关于Regulartarget&irregulartarget说明。
(5)打算用一个靶序列敲除2个或以上的同源基因时,选择同源基因中碱基完全相同的区域为靶位点。
(6)把靶点序列连接到sgRNA序列的5’端[(20bptarget)GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT],利用在线软件(http:
//mfold.rna.albany.edu/?
q=mfold/RNA-Folding-Form2.3)做二级结构分析。
靶序列与sgRNA序列产生连续配对7bp(注意:
RNA可以产生U-G配对)以上会抑制其与染色体DNA靶序列结合靶点,因此要避免使用连续配对7bp以上的靶序列。
3.2靶点接头设计
U6/U3基因由III型RNA聚合酶转录,转录起始点是确定的碱基位置。
例如,U6为G碱基,U3为A碱基。
因此,由U6/U3启动子驱动的sgRNA首碱基一定是G或者A。
但是设计的靶序列的首碱基不一定刚好是G或者A,因此设计接头引物时需分两种情况考虑:
(1)如果目标区NGG(PAM)上游第20碱基是A(用U3启动子)或G(用U6a~c启动子),作为常规靶点(regulartarget),将A/G下游19碱基可按下图所示合成接头。
常规靶点(regulartarget)接头(targetadaptor)的形式
注:
接头正向引物T#-F和反向引物T#-R命名是根据靶点在sgRNA表达盒的连接方向决定,不是基因方向决定,否则这些引物用于检测阳性克隆时容易搞错方向;另外注意设计引物(尤其反向引物)时的5’-3’方向。
(2)如果NGG上游第20碱基不是A或G,作为非常规靶点(irregulartarget),将20碱基为靶序列合成接头的形式
非常规靶点(irregulartarget)接头的形式
也就是说,所用启动子的转录起始点与NGG上游第20碱基相同的regular靶点就是合成19碱基+4碱基粘性末端(转录产生的靶点配对序列为A/G+19=20);不相同的irregular靶点就是合成20碱基+4碱基粘性末端。
对使用拟南芥的AtU3/AtU6启动子的靶点接头也是同样道理,但对接各启动子的粘性末端不同(见Figure3B)。
3.3OverlappingPCR法扩增sgRNA表达盒引物设计
见4.1.2(与3.2相同目的,自由选择用任一个方案)
4.pYLCRISPR/Cas9打靶载体构建原理
4.1靶点引物接头与sgRNA表达盒的连接和扩增
4.1.1sgRNA构建方法1(接头连接扩增法,与3.2对应):
连接接头后(连接操作见步骤5-5),有3种方法扩增sgRNA表达盒片段(Figure4):
(1)直接用GoldenGate位置特异引物(TableS1)做一轮PCR扩增。
此方案效果不那么稳定,且不能避免扩增下图的产物IV和产物V。
(2)做2轮巢式PCR,第一轮PCR用通用的U-F/gR-R做1个反应(引物序列见附录),第二轮PCR用位置特异引物扩增。
此方案扩增效果好且稳定,但同样不能避免扩增产物IV和产物V(注1)。
(3)做2轮巢式PCR,第一轮PCR做2个反应,分别用U-F/接头反向引物,和用接头正向引物/gR-R;第二轮为OverlappingPCR,用位置特异引物扩增出表达盒产物。
虽然此方案第一轮PCR需要做2个反应,但效果最好且能避免扩增产物IV和产物V,因此推荐使用此方法。
Figure4.GenerationofasgRNAexpressioncassettebyadaptor-ligationandPCRamplification
在第一轮PCR加热过程中(73-75度),有缺口的引物(Tm值低于U3/6和sgRNA序列)先解离,U3/6和sgRNA序列3’端(未解离)立即延伸补平,产生接头引物互补结合位点。
注1:
为了提高接头连接效率,本操作中使用较高浓度(0.05μM)的靶点接头,实际上大部分产生线性单端连接(产物II,III),而环状(双端)连接(产物I)较少。
另外,过度酶切,星活性,过度连接等都可能产生破坏的平滑末端,有可能连接产生双接头产物或的空载产物(产物IV和产物V)。
4.1.2sgRNA构建方法2(以OverlappingPCR往sgRNA表达盒导入靶序列)
这种方法不需要用BsaI切sgRNA质粒和连接反应,更加简便,不会产生上述的产物IV和V。
即设计的2条靶点引物3’端有15-17nt分别与U3/U6启动子和sgRNA配对,用PCR扩增出片段后进行第二轮overlappingPCR。
Figure5.ProceduresforgenerationofasgRNAexpressioncassettecontainingatargetsequencebyoverlappingPCR.ThechimericprimerswithtargetsequencestrandsaregiveninTableS2.ThefirstPCRcanbecarriedoutintwoseparatedreactionswithU-F/U#T#-andgRT#+/gR-Rprimerpair,respectively,orinonereactionwiththeall4primers.U#indicatesagivenpromoter,andT#+andT#-indicatestrandsofatargetsequence.
4.4靶标gRNA表达盒排列和扩增引物使用方法
本系统目前使用水稻来源的4个smallnuclearRNA启动子的表达水平为OsU6a>OsU6b>OsU6c>OsU3a。
但打靶成功效率好像与sgRNA的表达水平没有明显的相关性(即在水稻sgRNA水平不是限制性因素)。
当连接靶点多于4个时,为了降低相同启动子序列在农杆菌发生同源重组的可能性,使相同启动子间的距离尽量近(2个相邻的同向重复序列间能够发生同源配对的碱基对数少于该重复序列长度的1/2)。
因此建议U3、U6a~c启动子的使用和排列方式为:
1个靶点:
LacZ-U6a
2个靶点:
LacZ-U6a—U6b
3个靶点:
LacZ-U6a—U6b—U6c
4个靶点:
LacZ-U6a—U6b—U6c—U3
5个靶点:
LacZ-U6a—U6a—U6b—U6c—U3
6个靶点:
LacZ-U6a—U6a—U6b—U6b—U6c—U3
7个靶点:
LacZ-U6a—U6a—U6b—U6b—U6c—U6c—U3
8个靶点:
LacZ-U6a—U6a—U6b—U6b—U6c—U6c—U3—U3
注:
由于靶点接头5’端4个碱基形成的粘性末端是根据使用的不同启动子而不同,要注意其对应关系。
sgRNA表达盒特定位置引物对的使用方法(T1,T2为靶序列;U#为各启动子):
1cassette:
Pps-GGL/Pgs-GGR;
扩增相应的U#-T1-gRNA
2cassettes:
Pps-GGL/Pgs-GG2,Pps-GG2/Pgs-GGR;
扩增相应的U#-T1-gRNA,U#-T2-gRNA;
3cassettes:
Pps-GGL/Pgs-GG2,Pps-GG2/Pgs-GG3,Pps-GG3/Pgs-GGR;
扩增相应的U#-T1-gRNA,U#-T2-gRNA,U#-T3-gRNA;
4cassettes:
Pps-GGL/Pgs-GG2,Pps-GG2/Pgs-GG3,Pps-GG3/Pgs-GG4,Pps-GG4/Pgs-GGR;
扩增相应的U#-T1-gRNA,U#-T2-gRNA,U#-T3-gRNA,U#-T4-gRNA
5个或以上靶点:
如此类推。
4.5靶标sgRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9载体的连接方法
本载体系统可采用GoldenGatecloning(Engleretal.,2008;2009),Gibsonassembly方法(Gibson,etal.,2009,2010)2种策略组装Cas9载体和多个gRNA表达盒片段。
GoldenGateligation是利用BsaI(typeIIsrestrictionenzyme)的识别位点和切割位点不重叠的特性,可以设计出多种不同的且非回文结构的粘性末端(256-16=240种,减去的16种是回文结构;第6-7页的PCR扩增引物使用了16种)。
多个要连接的片段在连接点具有特异的互补末端可以连接(如图6,4个表达盒为例),而非连接点的末端之间不互补不能连接(相同末端分子间也不互补不能连接),因此连接反应是向着目标单方向进行,效率很高。
由于OsU6a-LacZ(AtU3b-LacZ)附有LacZ标记基因(198bp),可在含有X-gal的培养基产生蓝色菌斑筛选阳性克隆。
Figure6.Generationofa4-targetconstructbyGoldenGatecloning
注:
由引物Pps-GGL导入载体的唯一SpeI位点是特别留的一个“后门”。
其用途是,在构建好一组目的靶点sgRNA表达盒的载体的基础上,如果情况需要再添加第二组其它靶点sgRNA表达盒,可以用SpeI将载体切成线状,再用GibsonAssembly将第二组靶点sgRNA表达盒克隆进去。
如果连接较多(4个或以上)的sgRNA表达盒的效率低(转化不能获得阳性克隆),就以连接产物为模板,以引物PB-L/PB-R(见TableS1)扩增出连接的多个表达盒,再次与pYLCRISPR/Cas9载体酶切连接。
5.载体构建操作方法:
Figure7.Workingflowchartforpreparationofmulti-targetCRISPR/Cas9constructs
(1)菌种活化和质粒提取制备:
将pYLCRISPR/Cas9菌种(TOP10F’)和CRISPR/sgRNAvectors菌种(DH10B)分别在含有卡那霉素(25μg/ml)和氨苄青霉素(50μg/ml)平板培养基划线培养过夜,挑取单菌落培养1ml种子液,再扩大培养用于提取质粒。
用2-3UBsaI试切~150ng质粒(10μl),电泳检查(未切的80ng质粒为对照)。
注:
不要将保存的菌种直接接种!
关键点:
pYLCRISPR/Cas9载体较大(约15~16.5kb),拷贝数较低(pBR322复制子),用质粒小型柱提取纯化的回收率较低,因此最好用适合于较大质粒提取的大柱纯化试剂盒(如TIANGEN公司EndoFreeMaxiPlasmidKit)提取纯化(由于溶出的质粒DNA可能含有残留的洗液成分即乙醇,且体积大浓度低,最好再做一次标准的乙醇沉淀操作以去除残留乙醇和减少DNA溶液体积),或用普通碱裂解法提取(用酚/氯仿抽提2次后再乙醇沉淀)。
溶解在TE(约0.5g/l)保存。
取部分质粒稀释成约100ng/l冷冻保存,作为步骤(10)使用。
关键点:
由于接下来要用到的BsaI是很容易失活的酶,有时新买的BsaI也是失活的!
在进行以下步骤之前,先检测BsaI活性:
配制10μlBsaI反应液,含有5UBsaI,~100ngpYLgRNA-U#(或其它有AmpR基因的质粒)。
37℃反应15min后电泳检查,以未切的相同质粒为对照。
pYLgRNA-U#的BsaI图谱见Figure3。
为了尽可能保持酶活性,最好把BsaI分装成几管冷冻保存。
NEB公司的BsaI-HF经过修饰以降低星活性,推荐使用NEBBsaI-HF和配套的CutSmartBuffer。
●sgRNA表达盒构建方法1:
(2)靶点接头制备:
将接头引物TE溶解成100μM母液,各取1μl加入到98μl0.5xTE混合稀释到1μM。
约90℃30s,移至室温冷却完成退火。
(3)sgRNA载体酶切:
取pYLgRNA-OsU3/LacZ等质粒各1μg,在25μl反应用10UBsaI酶切20min,冷冻保存。
关键点:
不要用太多酶和太长时间过度酶切!
(4)sgRNA表达盒连接反应:
酶切过的pYLgRNA-OsU3/LacZ等质粒与各所对应接头连接反应:
成分
加入量
终浓度(量)
10×T4DNAligaseBuffer
1μl
1×
pYLsgRNA-U#质粒
0.5μl
10~20ng
接头
0.5μl
0.05μM
T4DNAligase(Takara)
0.05μl
~18U
ddH2O
补足到10μl
室温(20-28℃)连接约10-15min
关键点:
过多DNAligase和过长时间连接会产生较多第6页所述产物IV
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