肿瘤个体化治疗检测技术指南试行.docx

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肿瘤个体化治疗检测技术指南试行

肿瘤个体化治疗检测技术指南

（试行）

前言

肿瘤的个体化治疗基因检测已在临床广泛应用，实现肿瘤个体化用药基因检测标准化和规范化，是一项意义重大的紧迫任务。

本指南从诊断项目的科学性、医学实验室检测方法的准入、样本采集至检测报告发出的检测流程、实验室质量保证体系四个方面展开了相关论述，使临床医生能够了解所开展检测项目的临床目的、理解检测结果的临床意义及对治疗的作用；医学实验室为患者或临床医护人员提供及时、准确的检验报告，并为其提供与报告相关的咨询服务。

检测技术的标准化和实验室准入及质量保证对临床和医学实验室提出了具体的要求，以最大程度的保证检测结果的准确性。

本指南是参考现行相关的法规和标准以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及肿瘤个体化治疗靶点基因的不断发现，本技术规范相关内容也将进行适时调整。

本指南起草单位：

中国医学科学院肿瘤医院分子肿瘤学国家重点实验室、苏州生物医药创新中心，经国家卫生计生委个体化医学检测技术专家委员会、中国抗癌协会相关专业委员会、中华医学会检验医学分会、中华医学会肿瘤学分会的专家修订。

本指南起草人：

詹启敏、曾益新、王珏、姬云、钱海利、李晓燕、孙石磊

1.本指南使用范围

本指南由国家卫生计生委个体化医学检测技术专家委员会制定，是国家卫生计生委个体化医学检测指南的重要内容，旨在为临床分子检测实验室进行肿瘤个体化用药基因的检测提供指导。

本指南的主要适用对象为开展个体化医学分子检测的医疗机构临床分子检测实验室。

2.简介

肿瘤个体化治疗以疾病靶点基因诊断信息为基础，以循证医学研究结果为依据，为患者提供接受正确治疗方案的依据，已经成为现代医学发展的趋势。

临床研究证实，通过检测肿瘤患者生物样本中生物标志物的基因突变、基因SNP分型、基因及其蛋白表达状态来预测药物疗效和评价预后，指导临床个体化治疗，能够提高疗效，减轻不良反应，促进医疗资源的合理利用。

3.标准术语和基因突变命名

3.1标准术语

1）基因（Gene）:

是遗传物质的最小功能单位，是指具有一定生物学意义的一段DNA。

2）突变（Mutation）：

是细胞中DNA核苷酸序列发生了稳定的改变。

3）融合基因（Fusiongene）：

是指两个基因的全部或一部分的序列相互融合为一个新的基因的过程。

融合基因的表达产物为融合蛋白。

4）基因表达（GeneExpression）：

是基因中的DNA序列生产出蛋白质的过程。

步骤从DNA转录成mRNA开始，一直到对于蛋白质进行翻译后修饰为止。

5）基因扩增（geneamplification）：

为一特异蛋白质编码的基因的拷贝数选择性地增加而其他基因并未按比例增加的过程。

6）DNA甲基化（DNAMethylation）：

为DNA化学修饰的一种形式，将甲基添加到DNA分子上，例如在胞嘧啶环的5'碳上。

DNA甲基化能在不改变DNA序列的前提下，将DNA甲基化状态遗传至下一代细胞或个体。

7）聚合酶链反应（PCR）：

是一种体外扩增特异DNA片段的技术。

利用DNA在体外摄氏高温时变性会变成单链，低温时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5'-3'）的方向合成互补链。

8）质控品：

是含量或成分已知的处于与实际样本相同的基质中的特性明确的物质，这种物质通常与其他杂质混在一起，专门用于质量控制目的的样本或溶液。

3.2基因突变命名

人类基因组突变学会（HGVS）已建立系统的基因突变命名方法。

具体基因突变命名方法可查阅网站http:

//www.hgvs.org/mutnomen/index.html。

HGVS基因突变命名指南根据需求不断更新。

本文以2011年8月更新版本为准。

当描述某一序列改变时，其前缀表明其参考序列类型。

例如“g.”表示基因组序列，“c.”表示cDNA序列，“m.”表示线粒体DNA序列，“r.”表示RNA序列，“p.”表示蛋白序列。

在数据库中的收录号以及版本号应当在实验记录报告中列出，当两种突变在反式（intrans）中检测到，则用方括号表示。

例如，CF突变为杂合性突变（508号苯丙氨酸缺失和1303号天冬酰胺被赖氨酸替代），则在DNA水平规范描述方式为c.[1521_1523delCTT]+[3909C>G]。

3.3参考序列

美国国立生物技术信息中心（NCBI）收录的参考序列编码具有权威性及唯一性。

其中前缀“NM_”表示为mRNA序列，“NP_”表示多肽序列，“NG_”表示基因组序列。

基因组参考序列应列出完整基因序列，包括5'以及3'非编码区（UTR）。

当使用某段编码DNA参考序列描述突变时，应选择合适的转录体，且转录体的起始转录点应当明确，例如选择最常见的转录体，或者是已知的最大转录体，或者具有组织特异性的编辑转录体。

当某一参考序列具有多种转录方式时，选择NCBI数据库里注释最全面的版本。

3.4各类变异

3.4.1DNA序列变异术语规范

DNA核苷酸用大写字母A（腺嘌呤）、C（胞嘧啶）、G（鸟嘌呤）以及T（胸腺嘧啶）来表示。

用正链来表示DNA序列。

当DNA序列改变时，以相应核苷酸所在位置及相应字母来描述。

“>”符号表示“从某一变化至另一”。

在描述突变方式时，数字、字母、箭头、上标以及下标之间不应出现空格。

3.4.2RNA序列变异术语规范

RNA序列以小写字母a（腺嘌呤）、c（胞嘧啶）、g（鸟嘌呤）、u（尿嘧啶）进行描述。

RNA序列改变描述方式与DNA相类似。

具体术语可参阅HGVS网站（http:

//www.hgvs.org/mutnomen/index.html）。

3.4.3蛋白质序列变异术语规范

蛋白质序列改变通常以单个字母或三个字母（第一个字母大写）来描述。

尽管单个字母描述氨基酸明确无误，但是由于三联密码子相对于其编码的氨基酸存在冗余性，具体给出发生突变的三联体密码子可以更清楚地描述氨基酸改变方式。

例如，用来描述氨基酸的A（丙氨酸）、C（半胱氨酸）、G（甘氨酸）以及T（苏氨酸）可能会与核苷酸字母A（腺嘌呤）、C（胞嘧啶）、G（鸟嘌呤）以及T（胸腺嘧啶）相混淆。

3.4.4错义突变及无义变异术语规范

由于三联体密码子的简并性，多个位点核苷酸的改变可能不影响最终氨基酸序列。

因此，应该分别从DNA水平和氨基酸水平描述突变。

从DNA水平对某一突变位点的描述方式包括碱基位点，正常碱基，“>”符号，突变碱基。

例如，某一蛋白第551号氨基酸残基由G（甘氨酸）突变为D（天冬氨酸），从DNA水平描述即c.1652G>A。

在氨基酸水平，由于错义突变的产物以氨基酸残基位点以及表示氨基酸的单字母或三联体密码子来描述。

表示方法是野生型的氨基酸、位点、突变氨基酸，三者之间不要有空格。

例如，p.Gly551Asp表示该蛋白中551号甘氨酸残基（G）被天冬氨酸残基（D）所代替。

无义突变表示方法与之相类似。

需要指出的是“X”符号代表终止密码子。

例如，p.Gly542X表示542位点的甘氨酸残基被终止密码子所代替。

3.4.5缺失和插入术语规范

缺失和插入突变分别用前缀“del”和“ins”来表示，并注明突变位点以及碱基。

例如，c.441delA表示在该DNA序列中441号位点发生A碱基缺失。

c.241_243delATC表示在该DNA序列中从241号到243号缺失ATC三个碱基。

在蛋白水平，上述突变描述方式为p.Ile24del，表示该蛋白质中第24号的异亮氨酸残基发生缺失。

“indels”则表示该段序列缺失的同时有片段插入。

例如，234_239delAATTCGinsTA（或者234_239delinsTA）表示该DNA序列234至239号位点缺失AATTCG六个碱基，同时该段位点被新插入的TA碱基所替代。

3.4.6移码突变术语规范

移码突变用“fs”符号来表示。

“fs*#”则用于进一步描述突变类型。

例如，p.His62Profs*21表示该蛋白发生移码突变，第62号氨基酸由组氨酸突变为脯氨酸并产生新的阅读框架，终止于第62号密码子下游21号密码子处。

该突变也可简要描述为p.His62fs，即该蛋白从第62号密码子发生移码突变。

3.4.7碱基重复序列

HGVS推荐，核苷酸重复序列基因多态性描述时通常以一个重复序列为单元，后面加上“[重复的次数]”，如CGG[55]。

当重复序列的次数在一个范围之内时，需要在小括号“（）”中标注出可能的最少的和最高的重复次数，如某个人HTT基因中发现有12个和15个CAG重复，基因水平的表示如下：

c.52CAG[12]+[15]，蛋白水平则表示为：

p.Gln18[12]+[15]。

HTT基因的重复序列范围则描述为：

c.52CAG（27_35）或p.Gln18（27_35）。

3.4.8遗传药理学基因型术语规范

最广泛使用的命名法描述遗传药理学基因型不同于其他遗传学基因检测，例如代谢相关基因细胞色素p450家族，人类细胞色素P450（CYP）等位基因命名委员会（http:

//www.cypalleles.ki.se）推荐用“*”命名，见图1。

在该系统中，最常见的等位基因被指定为“*1”。

图1.细胞色素P4502D6等位基因命名规范

3.4.9其他

对于更复杂的突变，可参考HGVS（http:

//www.hgvs.org/mutnomen）建议的命名规则，解决其他复杂的变异的命名。

4.分析前质量保证

4.1样本类型及获取

4.1.1新鲜组织（包括手术和活检组织）

肿瘤新鲜冷冻材料可提取出最高品质的DNA、RNA。

在手术现场取样的情况也比较多，但需要在显微镜下确认肿瘤细胞含量。

周围炎症严重的肿瘤、黏液产生过高的肿瘤、病变中心广泛纤维化的肿瘤细胞不能采集，以免产生假阴性结果。

切割后取其中一半，并利用另一半切面制作组织标本，然后进行确认。

手术切除的组织样本理想的保存方法是迅速置于液氮中，然后保存于液氮罐或-80℃冰箱，这一过程应在手术样本离体后30分钟内完成。

由于组织样本通常需先进行病理学分析，在分析完成后应尽早将组织样本置于稳定剂中，避免核酸降解。

4.1.2石蜡包埋组织（formalin-fixedparaffin-embedded，FFPE）

10%中性福尔马林固定手术切除样本，按病理学操作规范进行取材。

制作石蜡切片时，切取5片连续切片，其中1片进行HE染色，确认肿瘤细胞的含量。

在高灵敏度检测方法中，可考虑使用活检标本。

DNA容易受固定的影响，长时间（1周以上）浸泡在福尔马林中的样本的DNA会被片段化，不能检出突变。

活检材料的固定时间一般是24小时，对于穿刺等活检样本，固定时间控制在6~24小时为佳。

4.1.3胸腹水等细胞学样本

用胸腹水中的肿瘤细胞用于基因检测时，必须确认肿瘤细胞，穿刺获得胸腹水样本提交给细胞病理检查之后，剩余液体冷藏/冷冻保存，也可在含有细胞成分的离心沉淀中加入含有蛋白质变性剂的缓冲液（AL缓冲液，Qiagen公司）等室温保存。

由于细胞学样本的肿瘤细胞含量较低，因此必须使用高灵敏度检测方法。

4.1.4血浆样本

循环DNA（circulatingfreeDNA，cfDNA）是存在于血浆中的游离DNA，肿瘤来源的DNA占血浆游离DNA的比例在不同肿瘤及病例中相差悬殊（0.01~93%），从而限制了外周血在肿瘤分子检测时的应用。

目前已有多篇文献证实可利用从血浆游离DNA检出突变，但需要使用ARMS法等灵敏度非常高的检测方法。

采集外周血提取血浆游离DNA进行检测，取样时应使用一次性密闭EDTA抗凝真空采血管，采集6~10ml全血，冷藏运输，6小时内分离血浆，提取游离DNA，保存到-80℃冰箱中，并避免反复冻融。

如外周血需长时间运输，建议用商品化的游离DNA样本保存管，在常温条件下，cfDNA在全血中可稳定保存7天。

4.2采样质量的评价

肿瘤细胞是否存在，是开展肿瘤个体化治疗基因检测的重要前提。

如果要确认肿瘤细胞存在，与病理诊断医生密切合作是非常必要的。

采样评价内容包括：

细胞组成、肿瘤细胞的数量，是否按照要求进行处理与运输。

评价方法包括肉眼观察、显微镜下观察和浓度分析等。

肿瘤组织切片等应经病理医师审阅，取一张切片HE染色后显微镜下观察，确保肿瘤细胞存在，并记录肿瘤组织含量，标注肿瘤细胞密集区域。

4.3样本采集中的防污染

样本采集最好采用一次性材料，不用处理便可直接使用；

制备不同患者病理切片样本时，需更换新刀片，并清除操作器皿上先前样本的残留；

采集中要特别注意防止污染，防止混入操作者的毛发、表皮细胞、痰液等；

如使用玻璃器皿，必须经高压灭菌，以使可能存在的DNase失活；

如提取RNA样品，必须采用RNase抑制剂措施和无RNase材料。

4.4样本运送和保存

原则上按照《个体化医学检测质量保证指南》要求进行。

实验室应建立详细的样本运送标准操作规程（SOP），对临床医生提供样本采集手册，要求物流人员填写相关运送记录表，确保运送过程中样本的安全性和过程的可控性。

需要转送的样本：

用于RNA检测的样本，如果未经稳定化处理，则必须速冻后，放在干冰中运送。

经过适当稳定化处理的样本可在常温下运送，如用于DNA扩增检测的EDTA抗凝全血样本及用于RNA扩增检测的经稳定化处理的样本。

5.分析中质量保证

5.1实验室设计要求

原则上按照《个体化医学检测质量保证指南》要求进行。

在符合国家卫生计生委要求的个体化医学检测实验室和通过审核验收的临床基因扩增检验实验室完成。

5.2检测方法

5.2.1Sanger测序法

5.2.1.1技术原理

Sanger测序法即双脱氧链终止法（ChainTerminationMethod），利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。

直到掺入一种链终止核苷酸为止。

每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸（dNTP），并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）。

由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。

终止点由反应中相应的双脱氧而定。

每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。

它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

5.2.1.2技术特点

该方法是DNA序列分析的经典方法，最直接的、可检测已知和未知突变的一种方法。

由于该方法可直接读取DNA的序列，因此被认为是基因分型的金标准。

主要优点：

测序长度较长，可发现新的变异位点，包括一些新的少见的突变形式及突变的确切类型，如点突变、片段缺失。

局限性：

灵敏度不高，突变等位基因需要超过20%才能检出。

对样本中肿瘤细胞的含量和比例要求较高，一般要求肿瘤细胞含量不低于50%，如果肿瘤细胞比例低于50%，则假阴性出现的概率会显著增加；不适用于活检或细胞学样本。

5.2.2焦磷酸测序法（Pyrosequencing）

5.2.2.1技术原理

焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。

当测序引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶等4种不同酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP聚合时释放的焦磷酸基团（PPi）与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列和定量分析序列变化的目的。

5.2.2.2技术特点

焦磷酸测序技术是一种新型的酶联级联测序技术，其重复性和精确性可与Sanger测序相媲美，而测序速度则大大提高，非常适合对已知的短序列进行重测序分析。

主要优点：

检测灵敏度为10%，相对Sanger测序法高，对体细胞突变和甲基化等可实现定量检测；分型准确可靠，通量较高，实验设计灵活，可发现新的突变或遗传变异。

局限性：

测序长度较短，不能对长片段进行分析。

检测灵敏度中等，难以检出低于10%的突变。

不适用于活检或细胞学样本。

5.2.3新一代测序（nextgenerationsequencing，NGS）

5.2.3.1技术原理

NGS又称大规模平行测序（MPS），包含多种可以一次性产生大量数字化基因序列的测序技术，是继Sanger测序的革命性进步，采用平行测序的理念，能够同时对上百万甚至数十亿个DNA分子进行测序，实现了大规模、高通量测序的目标。

不同厂家的产品测序原理不同，主要分为边合成边测序（Sequencingbysynthesis，SBS）、基于“DNA簇”和“可逆性末端终结（ReversibleTerminator）大规模平行测序、4色荧光标记寡核苷酸的连续连接反应测序和半导体芯片测序。

5.2.3.2技术特点

高通量测序技术不仅可以进行大规模基因组测序，还可用于基因表达分析、非编码小分子RNA的鉴定、转录因子靶基因的筛选和DNA甲基化等相关研究。

主要优点：

高通量测序技术有三大优点是传统Sanger测序法所不具备的。

第一，它利用芯片进行测序，可以在数百万个点上同时阅读测序。

第二，高通量测序技术有定量功能，样品中DNA被测序的次数反映了样品中这种DNA的丰度。

第三、利用传统Sanger测序法完成的人类基因组计划总计耗资27亿美元，而现在利用高通量测序技术进行人类基因组测序，测序成本只需1千美金。

局限性：

检测灵敏度和测序深度相关，一般来说，NGS在肿瘤体细胞突变检测时，检测灵敏度为10%；已知的与肿瘤相关驱动基因数量有限，疾病表型和基因型的关系还有赖于生物信息的解读，目前NGS应用于肿瘤细胞突变检测的标准化和质量控制尚未形成共识。

5.2.4扩增阻滞突变系统（ARMS）-PCR法

5.2.4.1技术原理

扩增阻碍突变系统（amplificationrefractorymutationsystem,ARMS）是PCR技术应用的发展，也称等位基因特性PCR（allele-specificPCR,AS-PCR）等，用于对已知突变基因进行检测。

该法通过设计两个5`端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯合性突变，分别加入这两种引物及3`端引物进行两个平行PCR，只有与突变DNA完互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物。

如果错配位于引物的3`端则导致PCR不能延伸。

5.2.4.2技术特点

ARMS-PCR是目前实验室常用的基因突变检测方法。

主要优点：

ARMS-PCR法检测灵敏度高，可检测肿瘤细胞中突变比例为1%甚至更低的突变基因。

局限性：

只能检测已知的突变类型，不能发现一些新的、未知的突变；如果检测的突变位点或类型较多，则随着引物数目增加出现非特异性结合的概率也相应增加；当检测位点较多时，对DNA样本量的需求增加。

5.2.5高分辨率熔解曲线（HRM）法

5.2.5.1技术原理

高分辨率熔解曲线（high-resolutionmelting，HRM）是一种基于PCR新型技术，用于检测基因变异包括未知的基因变异、单核苷酸多态性以及基因甲基化。

HRM是基于在加热过程中双链变性为单链的原则。

DNA双链体的熔解温度差异反应了基因的变异。

双链DNA片段在其特定的温度熔解，熔解的温度由片段的CG含量、序列组成、长度以及一个和多个杂合碱基决定。

用DNA嵌合的染料可以看到任何双链片段的熔解峰图，在有荧光嵌合染料的情况下PCR扩增片段，扩增后的产物通过一个快速的可控的加热处理开始熔解。

荧光水平在升温的过程中实时监测，染料随着双链DNA的熔解，荧光信号逐渐减少。

5.2.5.2技术特点

由于HRM分析不受碱基突变位点和种类的限制，可用于突变扫描、基因分型、序列匹配、DNA甲基化等方面的研究。

主要优点：

检测灵敏度1%，特异性高，重复性好；封闭体系，减少污染的可能性；扩增和检测同时进行，无需PCR后进行处理。

局限性：

通过熔解曲线的图不能判断某一特异性的变异体，下游分析中检测需要有测序等补充。

5.2.6数字PCR（DigitalPCR）

5.2.6.1技术原理

数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术。

相较于qPCR，数字PCR能够直接数出DNA分子的个数，对起始样品绝对定量。

通过将一个样本分成几万到几百万份，分配到不同的反应单元，每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子（DNA模板），在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。

数字PCR技术不断发展，Bio-Rad、LIFETechnologies、Fluidigm及RainDance等厂家相继推出技术较为成熟的数字PCR产品。

5.2.6.2技术特点

数字PCR目前的应用包括：

稀有等位基因检测、基因表达绝对定量、核酸标准品绝对定量、二代测序文库绝对定量等。

主要优点：

灵敏度可达0.001~0.0001%，高特异性，可检测复杂背景下的靶标序列；可高度耐受PCR反应抑制剂；不必依赖对照品或标准品，可对目标拷贝数直接进行精确的鉴定，分析微小的浓度差异；实验数据分析便捷，每个微滴的检测结果以阴性、阳性判读，数据分析自动化；可统计突变率，通过统计分析可得出靶点的突变率。

局限性：

数字PCR仪通量较低，目前通常能检测的信号为FAM和HEX。

一般单个反应2重反应效果最佳；数字PCR优点是灵敏度高，但是对于DNA浓度大的样本处理就没有优势，而且核酸浓度高时，每个微滴里面包含的拷贝数不符合泊松分布；数字PCR虽然不依赖标准曲线，但是每次反应之间存在差异，短期内不能代替qPCR，也不能代替其他金标准而作为首选方法。

QX200等数字PCR仪目前仅用于科研用途，数字PCR走向临床检验还需要一段时间。

5.2.7荧光原位杂交（FISH）

5.2.7.1技术原理

荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）是通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交，并在荧光显微镜下观察分析其结果的一种分子细胞遗传学技术。

它的基本原理是：

如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。

将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。

5.2.7.2技术特点

FISH主要可对基因缺失、基因融合、基因扩增进行检测。

主要优点：

可多种荧光标记，显示DNA片段及基因之间的相对位置与方向，空间定位精确；灵敏、特异性好，可同时分析分裂期和间期的多个细胞，并进行定量；可以检测隐匿或微小的染色体畸变及复杂核型。

局限性：

FISH检测对操作和判读技术要求较高，诊断医师必须经过严格的FISH操作和结果判读培训，只有经FISH操作经验丰富的医师判定的结果才具有可靠性；目前FISH检测的成本昂贵、通量低。

5.2.8免疫组化（IHC）

5.2.8.1技术原理

免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）分析利用抗体和抗原之间的结合的高度特异性，借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位和强度显示出来，以其达到对组织或细胞中的相应抗原进行定性、定位或定量的研究。

5.2.8.2技术特点

IHC作为筛查工具优于FISH，具有经济快捷的优点，尤其适用于大量样本的检测分析。

影响IHC结果的因素主要包括抗体的选择、检测前组织的固定，观察者解释方面的差别等。

5.2.9荧光定量逆转录PCR（Q-RT-PCR）

5.2.9.1技术原理

逆转录PCR（reversetranscription