基因工程复习重点.docx
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基因工程复习重点
《基因工程》复习重点
第一章绪论
1.克隆:
当它作为名词使用时,是指从一个祖先通过无性繁殖方式产生的后代,或具有相同
遗传性状的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体;当它作为动词使用时,是指
从同一祖先生产这类同一的DNA分子群或细胞群的过程。
因此,基因工程也可称为基因克
隆或DNA分子克隆。
2.基因工程诞生于1973年。
3.在现代分子生物学研究领域中,理论上的三大发现及技术上的三大发明对基因工程的诞生起到了决定性的作用。
1)理论上的三大发现
(1)40年代发现了生物的遗传物质是DNA而不是蛋白质。
(2)50年代明确了DNA的双螺旋结构和半保留复制机理。
(3)60年代确定了遗传信息的传递方式,即中心法则的建立和遗传密码子的破译。
2)技术上的三大发明
(1)利用限制酶和连接酶体外切割和连接DNA片段。
(2)质粒改造成载体以携带DNA片段克隆。
(3)逆转录酶的使用打开真核生物基因工程的一条通路。
4.基因工程:
对不同生物的遗传物质--基因,在体外进行剪切、组合和拼接,使遗传物质重新组合,然后通过载体(质粒、噬菌体、病毒等)转入微生物、植物或动物细胞内,进行无性繁殖,并使所需要的基因在细胞中表达,产生出人类所需要的产物或组建成新的生物类型。
五个方面的工程技术系统(基因、细胞、酶、微生物发酵、生化工程)是相互依赖、相辅相成的,但系统中基因工程占主导地位。
5.基因工程研究内容包括以下几个主要步骤:
(1)从现有的生物有机体基因组中,经过酶切消化或PCR扩增等方法,获得带有目的基因的DNA片段。
(2)在体外,将带有目的基因的外源DNA片段连接到具有选择标记的载体分子上,形成能够自主复制的重组DNA分子。
(3)将重组DNA分子转移到适宜的受体细胞,并使其一起增殖。
(4)从大量的细胞繁殖群体中,筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。
(5)由筛选出来的受体细胞克隆,提取出已经得到扩增的目的基因,供进一步分析研究使用。
(6)将分离到的目的基因克隆到表达载体上,导入受体细胞,使之在新的遗传背景下实现功能表达,产生出人类所需要的物质。
6.基因工程的四大要素:
目的基因、工具酶、载体、受体。
7.1976年6月23日,美国国立卫生研究院(NIH)正式公布了“重组DNA研究的安全准则”。
8.我国的基因工程相关法规:
1990年制定《基因工程产品质量控制标准》;1993年发布《基因工程安全管理办法》;1996年发布《农业生物基因工程安全管理实施办法》;2001年发布《农业转基因生物安全管理条例》
第二章基因工程的理论基础与基本技术
1.操纵子:
由几个功能相关的结构基因成簇排列而组成的一个基因表达的协同单位,称为操纵子。
如:
调节基因、启动子、操纵基因、结构基因共同组成一个操作子。
2.内含子:
是一个基因中非编码DNA片段,它分开相邻的外显子。
3.外显子:
是一个基因中编码蛋白序列。
严格地说,外显子是指保留在初级mRNA中不被
剪切掉的区域,包括5’非翻译区(5’UTR)、编码序列和3’非翻译区(3’UTR)。
4.GT-AG法则:
序列分析表明,几乎每个内含子5’端起始的两个碱基都是GT,3’端最后两个碱基总是AG,由于这两个碱基的高度保守性和存在的广泛性,有人把它称为GT-AG法则,即5’GT…AG3’。
5.卫星DNA:
真核生物基因组中高度重复的DNA,有一些20~30bp的极短序列,且以数
千个拷贝的串连方式排列,这种序列称为卫星DNA。
(在染色体DNA片段的氯化铯密度梯
度离心中,由于浮力密度的不同,这种重复序列在主带DNA附近出现的卫星带,因此称之
为卫星DNA。
)
6.Poly(A)尾巴在基因工程操作中的作用:
A、用Poly(T)作为合成cDNA第一链的引物;
B、用Poly(T)纯化柱从总RNA中分离mRNA。
7.可诱导调节是指一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下,由原来关闭的状态转变为工作状态,即在某些物质的诱导下使基因活化。
可阻遏调节是指基因平时都是开启的,处在产生蛋白质和酶的工作过程中,但由于一些特殊代谢物或化合物的积累将其关闭,阻遏了基因的表达,所以称为可阻遏基因。
8.基因工程操作中应注意的真核生物与原核生物的差异
①基因结构的差异
②启动子和RNA聚合酶的差异
③蛋白质的翻译后修饰加工(前体切割、二硫键、糖基化、甲基化、羰基化、磷酸化、乙酰化、硫酸化、丙烯酸化、豆冠酸化、软脂化)
④基因表达的调节(表达量)
⑤载体的差异
⑥蛋白质的纯化方便
9.结构基因是可以转录成为各种RNA(如rRNA、tRNA、snRNA)直接行使功能,或者转录
成信使RNA(mRNA)然后翻译成多肽链,最终形成各种功能蛋白质和酶。
从广义上讲,任何一种能够调节或限制其他基因活性的基因都可叫做调节基因,一般情况下则是指基因产物参与调节别的基因活性的基因(如阻遏基因等)。
首先转录成mRNA,然后由mRNA翻译成阻遏蛋白质或激活蛋白质,通常也称为转录因子或反式作用因子。
它们通常结合到结构基因的非编码区的顺式元件上起调控作用。
10.具有相同遗传信息的个体细胞间其所利用的基因并不相同,有的基因活动是维持细胞基本代谢所必需的,而有的基因则在一些分化细胞或受到外界刺激的细胞中活动。
前者称为管家基因,如编码核糖体蛋白、线粒体蛋白、糖酵解酶等的基因;而后者被称为奢侈基因。
11.假基因是多基因家族中的成员,因其碱基顺序发生某些突变而失去功能,不能表达或表
达异常,生成无生物活性的多肽。
12.基因组是指一个生物体、细胞器或病毒的全部基因。
原核生物基因组仅由一条环状的双链DNA分子组成,含有一个复制起点,它的基因组就是它的整个染色体。
但对于二倍体的高等生物,能维持配子体正常功能的最低数目的一套染色体构成的一个基因组。
对于植物细胞而言,则有3个基因组,即染色体基因组(核基因组)、线粒体基因组和叶绿体基因组。
13.碱抽提法提取质粒DNA
(1)原理
DNA双链在强碱条件下变性为DNA单链,而单链在中性条件下又可复性为双链。
闭合环状的质粒DNA,在变性后不会分离,复性快;染色体线性DNA和(或)有缺口的质粒DNA变性后双链分离,难以复性而形成缠绕的结构,与蛋白质—SDS复合物结合在一起,在离心的时候沉淀下去。
(2)所用试剂
①溶菌酶【在碱性条件(pH>8)下有活性。
】:
能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中
的-1,4糖苷键。
②葡萄糖:
增加溶液的粘度,维持渗透压,防止DNA受机械力(震荡)的作用而降解。
③EDTA:
Mg2+、Ca2+的螯合剂,可抑制DNA酶的活性,防止DNA被酶降解。
④NaOH-SDS
NaOH:
强碱,提供pH>12的碱性条件,使DNA双链变性。
SDS:
溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白,并结合成“蛋白—SDS”复合物,使蛋白质(包括DNA
酶)变性沉淀。
⑤NaAc-HAc缓冲液(冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8):
用来中和NaOH变性液,使
DNA复性。
【高浓度的NaAc有利于变性的大分子(蛋白质、DNA、RNA等)沉淀。
】
⑥乙醇:
用于沉淀DNA。
(DNA分子以水合状态“溶于”水里,乙醇能夺去DNA分子的水环
境。
)
⑦RNaseA:
降解RNA,以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。
⑧TE缓冲液:
DNA保存液。
由Tris-HCl和EDTA配制。
【Tris-HCl不含金属离子(不同于
磷酸缓冲液或硼酸缓冲液),有利于以后操作;EDTA抑制DNA酶,防止DNA被酶降解。
】
⑨酚-氯仿:
蛋白变性剂,进一步抽提DNA溶液中的蛋白质,使蛋白质沉淀。
但苯酚会残留
在DNA溶液中。
(现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。
14.计算DNA浓度:
ssDNA:
[ssDNA]=33×(OD260—OD310)×稀释倍数
dsDNA:
[dsDNA]=50×(OD260—OD310)×稀释倍数
ssRNA:
[ssRNA]=40×(OD260—OD310)×稀释倍数
15.衡量提取DNA的纯度
OD260/OD280>1.8可能有RNA污染
OD260/OD280<1.8可能有蛋白质污染
16.带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动,速度称为电泳迁移率。
17.琼脂糖凝胶电泳的原理:
溴化乙锭(EB)是扁平分子,能插入DNA碱基之间,300nm紫外光照射下能发红色荧光。
与已知浓度的DNA电泳带荧光强度对比,就可以估计出DNA含量。
18.相同分子量的DNA:
闭合环状卷曲超螺旋迁移最快,线性分子次之,伸展开环状最慢。
19.琼脂糖凝胶的分辨力:
空隙大小决定其分辨分子大小的能力。
空隙小,分辨率高:
小分子较易通过,而大分子难通过;
空隙大,分辨率低:
大小分子几乎以同等速率通过。
20.影响DNA琼脂糖凝胶电泳迁移率的因素有哪些?
(1)DNA分子的大小。
(2)DNA的构象。
(3)琼脂糖浓度。
(4)溴化乙锭使DNA迁移率下降15%。
(5)电压。
(6)电泳缓冲液的成分及浓度。
21.聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多。
(琼脂糖凝胶电泳:
分离300—50000bp;
聚丙烯酰胺凝胶电泳:
分离1—1000bp)
22.核酸的分子杂交:
Southernblot--用DNA(或RNA)探针检测DNA样品。
Northernblot--用DNA(或RNA)探针检测RNA样品。
原位杂交--对应的菌斑或噬菌斑位置不变,可以直接找出阳性菌落。
23.聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)技术是利用酶促反应在体外指导特定DNA序列扩增的方法,以热变性的双链DNA分子为模板,利用引物和四种脱氧核苷三磷酸(dNTPs)为原料在DNA聚合酶的作用下大量扩增了特定的DNA片段。
1986年H.A.Erilish从嗜热水生菌分离出耐高温的TaqDNA聚合酶,代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段(37℃),PCR技术才进入实用阶段。
1988年R.K.Saiki把TaqDNA聚合酶用到PCR反应中,使PCR自动循环仪成为可能。
PCR技术的原理:
引物:
人工合成的单链DNA小片段,碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的5’端相同。
引物为什么优先与模板互补配对?
(浓度高,配对序列短)
PCR的特点:
(1)特异性强
(2)敏感性高
(3)快速
(4)简便
(5)可以扩增mRNA
TaqDNA聚合酶的特点:
(1)热稳定性,最适温度高(为75-80℃);
(2)具有5’3’聚合酶活性和5’3’外切酶活性,但没有3’5’外切酶活性;(因此不能修复错误的碱基配对!
)
(3)Taq的PCR产物3’端往往带有一个A;
(4)TaqDNA聚合酶的激活剂,金属离子敏感(尤其是Mg2+)。
PfuDNAPolymerase:
有3’5’的外切酶活性,5’3’外切酶活性。
是目前已发现的所有耐高温DNA聚合酶中出错率最低的。
但PCR产物为平端!
影响PCR的因素:
(1)DNA聚合酶活性
(2)引物
(3)模板(纯度、模板的量)
(4)dNTPs
(5)Mg2+的浓度
引物设计应注意的问题有:
1)引物的位置:
与待扩增的模板DNA区段的两3’端序列互补(5’端相同);
2)引物的长度:
一般引物设计为长15—30bp;
3)尽可能提高G+C含量,以提高引物与模板的结合力,碱基随机分布,一般G+C%含量宜在45-55%左右;
4)避免形成引物二聚体;
5)避免连续相同碱基排列或内部回文序列;
6)3`端碱基最好选T,C,G而不选A,这样有利于延伸;
7)3’端必须与模板正确配对,5’端可以不配对,5’端根据需要可设计成某个内切酶的切点顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等,方便于以后操作。
注----引物的Tm值手工计算:
Tm=(G+C)4+(A+T)2
标准的PCR反应体系
100ul25ul
1.引物各0.1umol
2.4种dNTP各200umol/L
3.10×buffer10ul2.5ul
4.模板DNA0.1~2ug0.025~0.5ug
5.Taq酶2.5u0.625u
6.Mg2+1.5mmol/L
7.ddH2O加至100ul加至25ul
如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸序列反推出来的,就必须考虑密码的简并性。
需要合成多种序列的引物,彼此间只有一个或几个碱基差异。
这样的混合引物称简并引物。
套嵌引物:
设计多组引物,结合位点依次位于前一组引物之间。
增加扩增产物的特异性。
PCR技术的延伸技术:
(1)荧光实时定量PCR【Real—time PCR(或TaqMan PCR)】
借助于荧光信号来检测PCR产物。
可以做到PCR每循环一次就收集一个数据,建立实时扩增曲线,准确地确定Ct值,从而根据Ct值确定起始DNA的拷贝数,做到真正意义上的DNA定量。
Ct值:
样品到达阈值水平所经历的循环数。
(2)反向PCR
扩增两个引物外侧的未知序列。
技术关键:
把线性DNA模板转变成环形分子。
(3)不对称PCR
用于扩增单链DNA,单链DNA更适于测序。
技术关键:
两个引物的浓度相差100倍。
(4)反转录PCR(RT-PCR)
扩增RNA模板。
如mRNA或RNA病毒。
技术关键:
利用反转录酶,把RNA反转录成cDNA,再以cDNA为模板进行PCR扩增。
(5)巢式PCR(Nest-PCR)
(6)原位PCR(in-situPCR)
(7)锚定PCR(anchoredPCR)
定义:
扩增已知序列侧翼未知序列的一种PCR方法,未知的3’端添加一同聚物尾(polyG),以互补的同聚物引物(polyC)和按已知序列设计的引物一起作PCR扩增。
关键:
利用末端转移酶在未知一端创造引物结合位点。
(8)长片段PCR(LongPCR)
(9)多重PCR(multiplexPCR)
定义:
又称多重引物PCR或复合PCR,它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物,同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。
(10)RAPD【随机扩增多态性DNA(RandomamplificationpolymorphismDNA,简称RAPD标记)】
定义:
用一个(有时用两个)随机引物(一般6-10个碱基)非定点地扩增基因组DNA,然后用凝胶电泳分开扩增片段。
(11)AFLP【扩增片段长度多态性(Amplifiedfragmentlengthpolymorphism,简称AFLP
标记)】
(12)RFLP【限制性片段长度多态性(Restrictionfragmentlengthpolymorphism,简称RFLP
标记)】
(13)SSR
简单序列重复标记(Simplesequencerepeat,简称SSR标记)
微卫星序列重复,是由一类由几个核苷酸(1-5个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列,长度较短,广泛分布在染色体上。
(14)ISSR
ISSR(inter-simplesequencerepeat)重复序列的间隔序列的扩增
(15)SSCP分析
单链构象多态性分析(Single-StrandConformationPolymorphism)
PCR技术的应用:
(1)扩增某一段DNA
(2)基因的体外诱变(3)基因组的比较研究
24.双脱氧链终止法
原理:
(1)DNA复制是以一条链为模板,按碱基配对的原则进行的。
(2)脱氧核糖的连接是以3’5’磷酸二酯键。
(3)复制反应可以在体外进行。
(4)2’和3’双脱氧的ddNTP会使复制反应终止。
(5)各碱基随机终止产生所有不同长度的产物。
(6)根据电泳条带的先后次序,读出合成链碱基序列,互补配对推出模板链碱基序列。
技术要点:
(1)制备单链DNA模板
(2)特殊的DNA多聚酶
①不能有5’3’和3’5’的外切酶活性;
②与模板的亲和力高,不会提前脱离模板。
(3)制备2’和3’双脱氧的ddNTP(dNTP/ddNTP=100/1)
(4)制备一小段单链引物(DNA或RNA)
注----化学裂解法读出的序列就是要测的序列。
Sanger测序法读出的序列是新合成的互补链序列。
第三章基因工程的工具酶
一、限制性核酸内切酶
1.定义:
一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列(4—8bp),并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。
2.限制作用:
指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用,破坏入侵的噬菌体DNA,导致噬菌体的寄主幅度受到限制。
这是维护宿主遗传稳定的保护机制。
修饰作用:
指寄主本身的DNA,由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化,使DNA得以修饰,从而免遭自身限制性酶的破坏。
这是宿主细胞识别自身遗传物质和外来遗传物质的作用机制。
3.类型:
I型、II型、III型
4.II型限制性内切酶(分离的第一个酶是HindⅡ)
(1)识别位点序列:
未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列(多数是回文序列)。
与
DNA的来源无关。
(2)切割位点:
识别位点处。
(3)同裂酶:
识别位点的序列相同的限制性内切酶。
①完全同裂酶:
识别位点和切点完全相同。
②不完全同裂酶:
识别位点相同,但切点不同。
(4)同尾酶:
识别的序列不同,但能切出相同的粘性末端。
注:
同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。
(5)如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率,称为星号(*)活性。
EcoRI和BamHI等都有*活性。
(6)Ⅱs型限制性内切酶
移动切割:
Ⅱs型限制与修饰系统,与Ⅱ型具有相似的辅因子要求,但识别位点是非对称,也是非间断的(不是从识别位点序列中间断裂),长度为4-7bp,切割位点可能在识别位点一侧的20bp范围内。
在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割DNA双链。
应用:
基因表达系列分析技术(SerialAnalysisofGeneExpression,SAGE)是以DNA序列测定为基础分析全基因组表达模式的技术。
任何长度超过9-10个碱基的核苷酸片段都可能代表一种特异性的转录产物,因此,根据某个序列占总标签数的比例可分析所对应基因的表达频率。
5.命名:
(1)用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。
(2)用一个右下标的大写字母表示菌株或型。
如Ecok,EcoR(现在都写成平行,如EcoRI)。
(3)如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统,用罗马字母表示。
如EcoRI,EcoRV。
(4)限制酶前面要带上R(Restriction),
修饰酶前面要带上M(Modification)。
(现已省略)。
6.识别序列的长短与切割频率:
识别序列越长,切割频率越小(越短,越大)
7.相邻序列效应:
大多数限制性核酸内切酶对只含识别序列的寡核苷酸是不具催化活性。
位点偏爱:
不仅侧翼序列长短与限制性核酸内切酶的切割效率有关,而且发现侧翼序列的核苷酸组成与切割效率也有关系。
8.影响限制性内切酶活性的因素
1)DNA的纯度
2)DNA的甲基化程度
3)温度(大多数是37℃,少数要求40-65℃)
4)缓冲液
9.完全消化:
内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。
局部消化:
只有有限数量的酶切位点被切开。
(通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。
)
10.几种常用限制酶识别位点:
二、DNA连接酶
1.两种DNA连接酶:
(1)大肠杆菌连接酶(只能连接粘性末端)
(2)T4噬菌体的连接酶(不但能连接粘性末端,还能连接齐平末端)
2.连接条件:
(1)必须是两条双链DNA;
(2)DNA3’端有游离的-OH,5’端有一个磷酸基团(P);
(3)需要能量:
动物或噬菌体中:
ATP
大肠杆菌中:
NAD+
3.影响连接反应的因素:
1)插入片段与载体的浓度比例
插入片段浓度高,至少2︰1。
增加插入片段与载体的接触机会,减少载体自我连接的现象。
2)反应温度(一般14~16℃)
三、DNA聚合酶
1.常用的DNA聚合酶的共同特点:
把dNTPs连续地加到引物的3’—OH端。
A、都以dNTP为底物。
B、都需要Mg2+激活。
C、聚合时必须有模板链和具有3’-OH末端的引物链。
D、链的延伸方向都为5'→3'。
主要区别:
持续合成能力和外切酶活性不同。
2.用枯草杆菌蛋白酶处理大肠杆菌DNA聚合酶I可以切掉N端的5’3’外切酶活性部分,就成为Klenowfragment。
3.切口平移法:
DNA聚合酶I同时具备5’3’外切酶活性和5’3’的聚合酶活性(以及3’5’外切酶活性)。
5’3’外切酶活性从DNA切口的下一段DNA5’端除去一个核苷酸后,聚合酶活性就会在切口的上一段DNA的3’一侧补上一个新的核苷酸。
4.放射性标记的优点:
制作简单、高比放射性、放射自显影效果好。
缺点:
半衰期短(32P只有14.3天)、不易保存、对人体有害、要求在专门
实验室操作。
5.地高辛的识别——抗地高辛抗体,生物素的识别——亲和素
6.常用的两种偶联酶:
辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶(AP)
作用:
催化一些特殊的反应,反应的过程中发出荧光
(或生成有色的产物)。
7.用非放射性标记的探针检测原理:
探针DNA用生物素或地高辛标记。
亲和素或地高辛抗体与酶偶联。
酶催化一个发光或显色反应。
亲和素或地高辛抗体与生物素或地高辛结合。
四、DNA修饰酶
(一)末端脱氧核苷酸转移酶的特性:
①需要3’—OH、二甲胂酸缓冲液;
②不需要模板;
③底物可以是单链DNA、3’—OH突出的双链DNA、平末端在Co2+代替Mg2+下也可以;
④随机添加的dNTPs。
如果只有一种dNTP,就添加上同聚物。
(2)T4多核苷酸激酶的功能:
催化磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5’-OH
端。
不论5’-OH端突出与否。
(三)碱性磷酸酶
1.种类:
①细菌性碱性磷酸酶(BAP):
从大肠杆菌中分离出来,具有抗热性。
②小牛肠碱性磷酸酶(CIP):
从小牛肠中纯化出来,SDS中加热68℃可完全失活。
2.特性:
催化脱掉DNA(或RNA)5’端的磷酸根。
3.功能:
防止线性化的载体份子自我连接
(四)S1核酸酶
1.特性:
(1)高度单链特异性
(2)反应条件:
①低水平Zn2+②pH4.0~4.3
2.功能:
(1)催化单链RNA或DNA降解。
(2)切掉双链核酸中的单链区。
(3)降解限制酶切形成的单链突出端。
(4)不能降解双链DNA或RNA-DNA杂交链。
第4章基因工程载体
质粒载体的容量相对较小,受转化率、拷贝数的影响。
M13噬菌体包装DNA分子的能力可达其DNA长度的6倍。
6407bp*6
噬菌粒能插入10kb的外源DNA。
载体的最大克隆容量是23kb。
(实际上为15kb)
柯斯质粒45kb。
(最少不能低于30kb)
细菌人工染色体克隆容量可达300kb。
载体的定义
广义上通常把能携带
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- 基因工程 复习 重点