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3果蔬成分分析
果蔬成分生化分析
温州大学生命与环境科学学院作者:
xxxx
指导老师:
xxxx
摘要:
果蔬中营养成分多种多样,本实验以盘菜,萝卜,豆芽梨子等为研究对象,对其主要营养成分(维生素C含量、总糖及还原糖含量、蛋白质含量)测定与其过氧化物酶分析都运用了比色法,并对测得数据列图表,进行对比研究。
结果表明:
新疆苹果中的主要营养成分相对于宁夏苹果含量高,但其过氧化物酶活性低于宁夏苹果,这说明其酚类物质代谢能力低于宁夏苹果。
总的来说,新疆苹果与宁夏苹果营养价值都高,但新疆苹果相对于宁夏苹果营养。
关键词:
主要营养成分;过氧化物酶
1.前言:
蔬菜,是指可以做菜、烹饪成为食品的,除了粮食以外的其他植物(多属于草本植物)。
蔬菜是人们日常饮食中必不可少的食物之一。
蔬菜可提供人体所必需的多种维生素和矿物质。
据国际粮农组织1990年统计,人体必需的维生素C的90%、维生素A的60%来自蔬菜。
此外,蔬菜中还有多种多样的植物化学物质,是人们公认的对健康有效的成分,如:
类胡萝卜素、二丙烯化合物、甲基硫化合物等。
目前果蔬中的营养素可以有效预防慢性、退行性疾病的多种物质正在被人们研究发现。
蔬菜中含有多种营养成分,其主要要营养特点如下:
1)水分—新鲜蔬菜的含水量在90%以上,它是蔬菜鲜嫩程度的标志。
2)维生素—绿色、橙色蔬菜中含有较多的胡萝卜素、维生素c、核黄素及叶酸。
3)无机盐—蔬菜是无机盐的重要来源。
绿色蔬菜含量最为丰富。
4)食物纤维—各种蔬菜都含有,它有促进肠道蠕动、降低胆固醇和改善糖代谢等作用。
水果是指多汁且有甜味的植物果实,不但含有丰富的营养且能够帮助消化。
是对部分可以食用的植物果实和种子的统称。
水果类的营养价值近似蔬菜,但所含无机盐和维生素不及蔬菜,其特点为:
1)各种鲜水果都含有维生素c,因其多生吃,故损失较少。
2)水果中的纤维素、果胶是天然的缓泻剂。
3)水果具有芬芳的果味,鲜艳的色彩能促进食欲。
4)水果含有较多的钠、钾、镁等元素,合成碱性食物。
2.材料、试剂与器材
2.1材料
各种水果和蔬菜
2.2试剂
(一)果蔬中维生素C的测量测定
1%草酸溶液、2%草酸溶液、维生素C标准液、氧化型0.1%2,6—二氯酚靛酚溶液
(二)果蔬中总糖及还原糖含量测定
蒽酮试剂、标准葡萄糖溶液(0.1mg/mL)、6mol/LHcl溶液、20%NaoH溶液
(三)果蔬中蛋白质含量测定
标准蛋白质溶液、考马斯亮兰G—250染料试剂、0.05mol/LTris—Hcl缓冲液(PH6.8)
(四)①聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物酶同工酶实验
A(分离胶缓冲液)、B(浓缩胶缓冲液)、C(分离胶贮液)、D(浓缩胶贮液)、E核黄素、F蔗糖、TEMED、0.14%过硫酸铵、电极缓冲液、封板胶、上样缓冲液、染色液
②过氧化物酶活性的测定
100mmol/L磷酸缓冲液PH6.0
反应混合液:
100mmol/L磷酸缓冲液(PH6.0)50ml于烧杯中,加入愈创木酚28μl,于磁力搅拌器上加热搅拌,直至愈创木酚溶解,待溶液冷却后,加入30%过氧化氢19μl,混合均匀,保存于冰箱中。
2.3器材
台秤;
可见光分光光度计;
恒温水浴锅;
高速离心机;
漩涡混合器;
垂直板电泳槽及附件(玻璃板、硅胶条、梳子、导线等);
稳压稳流直流电泳仪;
微量注射器。
各种玻璃器皿
3.实验方法
3.1试验设计
实验一果蔬中维生素C的定量测定
Ⅰ步骤
1、制备新鲜果蔬液:
洗净新鲜果蔬,擦干表面水分,剥去外皮,称取1g实验材料放入研钵中,研磨成匀浆,转入锥形瓶中,并用约30ml蒸馏水冲洗研钵2-3次,洗出液也转入锥形瓶中,于50℃水浴中保温约30min,取出,冷却后定容至100ml,过滤,滤液即是(若样品中含大量铁,可用8%醋酸溶液提取,可在一定程度上延缓Fe2+还原染料),在冰箱中保藏。
称取实验材料1g放入研钵中,加水3ml,研磨成匀浆,转入锥形瓶中,并用约12ml蒸馏水冲洗研钵2-3次,洗出液也转入锥形瓶中,再向锥形瓶中加入6mol/l的盐酸10ml,搅拌后在沸水浴中水解30min,冷去后用20%NaoH溶液中和至PH为中性,然后用蒸馏水定容至100ml,冰箱保存。
Ⅱ实验结果
维生素c标准液
0.41ml
样品液
0.43ml
0.46ml
盘菜样品液
0.58ml
0.56ml
结果计算:
v=(0.43+0.46)/2=0.445
M1=0.445×10/41=89/820
M2=89/820×4×5=2.17
所以白萝卜每100克样品中含维生素2.17g
同理得:
每100克的盘菜样品中含维生素c2.80g
实验结论:
盘菜的维生素含量比白萝卜高。
实验二果蔬中总糖及还原糖含量的测定
Ⅰ步骤
1、葡萄糖标准曲线的绘制:
取洁净试管6支,按表1进行操作:
表1蒽酮比色法定糖——标准曲线的制作
0
1
2
3
4
5
标准葡萄糖溶液/mL
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
蒸馏水
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
置冰水浴中5min
蒽酮试剂
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
煮沸10′,冷却后室温放置10′,在620nm处比色
A620nm
以吸光度为纵坐标,各标准液浓度(mg/mL)为横坐标做图得标准曲线。
2、样品中还原糖的提取和测定
称取1g实验材料,加水约3mL,在研钵中磨成匀浆,转入三角烧瓶中,并用约30mL蒸馏水冲洗研钵2~3次,洗出液也转入三角烧瓶中。
于50℃水浴中保温约0.5h(使还原糖浸出),取出,冷却后定容至100mL。
过滤后冰箱保存。
不同果蔬需进行不同程度稀释。
水果如柚子等:
取滤液1mL→100mL;蔬菜如盘菜、萝卜等取滤液10mL→100mL。
取1mL最终稀释液置于试管中,浸于冰浴中冷却,再加入4mL蒽酮试剂,沸水浴中煮沸10min,取出冷却后比色,其他条件与做标准曲线相同。
测得的吸光度值由标准曲线查算出样品液的糖含量。
3、样品中总糖的提取、水解和测定
称取1g实验材料,加水约3mL,在研钵中磨成匀浆,转入三角烧瓶中,用约12mL蒸馏水冲洗研钵2~3次,洗出液也转入三角烧瓶中。
再向三角烧瓶中加入6mol/L盐酸10mL,搅拌均匀后在沸水浴中水解0.5h,冷却后用20%NaOH溶液中和至pH呈中性。
然后用蒸馏水定容至100mL,过滤后冰箱保存。
不同果蔬需进行不同程度稀释。
水果如柚子等:
取滤液5mL→100mL;蔬菜如盘菜、萝卜等:
取滤液10mL→100mL。
取1mL总糖的最终稀释液同上法进行还原糖测定。
六、计算
按照下列公式分别计算实验材料中还原糖和总糖的质量分数(W)。
W(还原糖)=×100%
W(总糖)=×0.9①×100%
式中:
W(还原糖):
还原糖质量分数(%)
W(总糖):
总糖质量分数(%)
C1:
还原糖的质量浓度(mg/mL)
C2:
水解后还原糖的质量浓度(mg/mL)
V1:
样品中还原糖提取液的体积(mL)
V2:
样品中总糖提取液的体积(mL)
m:
样品质量
①乘0.9是为了从测定出的总糖水解成的单糖中扣除水解时所消耗的水量。
实验结果:
葡萄糖浓度g/L
Abs
0.01
0.054
0.02
0.112
0.03
0.158
0.04
0.212
0.05
0.257
萝卜还原总糖
0.464
萝卜总糖
0.881
盘菜总糖
0.388
盘菜还原总糖
0.349
经过计算得:
每萝卜还原糖质量分数为:
9.03%
萝卜总糖质量分数:
17.14%
盘菜还原糖质量分数:
6.79%
盘菜总糖质量分数:
7.549%
实验三果蔬中蛋白质含量测定
Ⅰ步骤
1、标准曲线绘制
取7只试管编号,按下表加入各试剂:
试剂
0
1
2
3
4
5
6
牛血清白蛋白标准液
0.0mL
0.1mL
0.2mL
0.4mL
0.6mL
0.8mL
1.0mL
蒸馏水
1.0mL
0.9mL
0.8mL
0.6mL
0.4mL
0.2mL
0.0mL
甲试剂
5.0mL
5.0mL
5.0mL
5.0mL
5.0mL
5.0mL
5.0mL
混匀,于20~25℃(或室温下)放置10min
乙试剂
0.5mL
0.5mL
0.5mL
0.5mL
0.5mL
0.5mL
0.5mL
迅速混匀,20~25℃(或室温下)放置30min,用分光光度计,在波长500nm下,以“0”号管调零,测定各管吸光度。
以各管吸光度为纵坐标,各标准蛋白浓度为横坐标,绘制标准曲线。
2、样品制备
称取1g待测植物鲜样置于冰浴上的研钵内,加入1mLH2O或0.05mol/LTris-HCl缓冲液(pH6.8)研成匀浆,转入离心管,再用2mL水或缓冲液将附着在研钵壁上的研磨样品洗下并全部转入离心管(注:
盘菜,萝卜稀释至10mL,其余稀释至5mL),3500rpm离心15~20min,其上清液即为蛋白质的提取液,供分析用。
3、样品测定
取2只试管编号,按下表加入试剂:
试剂
空白管
测定管
蛋白质提取液
-
1.0mL
蒸馏水
1.0mL
-
甲试剂
5.0mL
5.0mL
混匀,于20~25℃(或室温下)放置10min
乙试剂
0.5mL
0.5mL
迅速混匀,20~25℃(或室温下)放置30min,用分光光度计,在波长500nm下,以“0”号管调零,测定各管吸光度。
Ⅱ实验数据
盘菜
0.921
萝卜
0.436
牛血清蛋白溶液ug/L
Abs
0
0
20
0.104
40
0.215
60
0.314
80
0.468
100
0.507
实验结果:
M(盘菜)=1737.74g
M(萝卜)=822.64g
实验四
1聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物酶同工酶实验
Ⅰ步骤
1.贮液配制
按上表配制贮液,但应注意
(1)配好的贮液用棕色瓶盛装置冰箱内保存,可放1~2个月。
(2)过硫酸铵应当天配制。
2.电泳槽的安装
垂直板电泳槽的式样很多,目前流行的是用有机玻璃做的两个“半槽”组成的方形电泳槽,中间夹着凝胶模子,是由成套的两块玻璃板装入一个用硅酮橡胶做成的模套而构成,由硅酮橡胶套决定两玻璃板之间距离约为1.5mm,形成一个“胶室”,胶就在这两板之间的胶室内聚合成平板胶。
当凝胶模子与两半槽固定在一起后,凝胶槽子两侧形成前后两个槽,供装电极缓冲液和冷凝管用。
将两块玻璃板用去污剂洗净,再用蒸馏水冲洗,直立干燥(勿用手指接触玻璃板面,可用手夹住玻璃板的两旁操作),然后正确放入硅胶条中,夹在电泳槽里,按对角线顺序旋紧螺丝,注意用力均衡以免夹碎玻璃板。
安装好电泳槽后用1%琼脂溶液(1g琼脂加电极缓冲液(注:
已稀释10倍)至100mL,煮沸→冷却至60~70℃时用)封底,待琼脂凝固后即可灌制凝胶。
3.制胶
将贮液由冰箱取出,待与室温平衡后再配制工作液。
(1)配制分离胶
A3mL
C6mL
0.14%过硫酸铵12mL
水3mL
TEMED15μL
将分离胶沿长玻璃板加入胶室内,小心不要产生气泡,加至距短玻璃板顶端3cm处,立即小心地覆盖2~3mm的水层,静置待聚合(约40min),当胶与水层的界面重新出现时表明胶已聚合。
`#g;}1X&c2R#Q
(2)配制浓缩胶
B1.5mL
D3mL
E1.5mL
F6mL
TEMED18μL
0P'R2z6D2s:
Y$G6R!
c3k0b.G7e5T1P.J&Q&~&j9q注:
TEMED在灌胶前加,或者加完之后放在黑暗的环境中。
3B Q4c)F:
y(W8J先倒掉分离胶上的水层,用吸水纸将水层吸干,但不要弄坏分离胶。
立即加入浓缩胶,插入梳子(即样品槽模板),待胶凝后,小心取出梳子。
将稀释10倍的电极缓冲液倒入两槽中,上槽(短板侧)缓冲液要求没过样品槽,下槽(长板侧)缓冲液要求没过电极,备用。
"m8S)X1Y*?
"c9w-K0r*A8H9J(_4.样品的制备(过氧化物酶的提取)
按下列比例称取果蔬:
梨:
1:
2
柚子:
1:
5
萝卜与盘菜:
1:
10(W:
V=g:
mL)
剪碎,放入研钵中,加适量石英砂及样品提取液于冰浴上研磨成匀浆,置于离心管中,研钵用少量提取液清洗,洗液并入离心管,以14000r/min的转速离心15min,取上清液贮存于低温冰箱备用。
5.点样
6|+X/M @7Z.J:
I+J5r;[用微量注射器(50μL)吸取适量样液,在浓缩胶上层点样。
点样量:
柚子、梨:
20、40、50μL
萝卜、盘菜:
10、20、30μL
点样时须小心,防止样品液扩散。
向上槽液中滴加0.1%溴酚蓝2~3滴。
7G.k!
F/O-R6h5S%J*E6.电泳
#I/o3K-Q;F1r2O N接好电源线(上槽即加样槽为负极)。
打开电源开关,调节电流到10mA左右,样品进入到分离胶后加大到30mA,维持恒流。
待指示染料下行到距胶板末端1cm处,即可停止电泳。
把调节旋扭调至零,关闭电源,电泳约3h。
7.剥胶
.j1R1n%u:
?
6b7{3d5W取出电泳胶板,去掉胶套,用微量注射器沿玻璃内面注入一定量的水后即可掀开玻璃,去掉浓缩胶(注意先进行测量),将分离胶放入培养皿。
8.染色、记录结果
将配制好的染色液倒入培养皿,室温下1~10min后显示蓝色条带,后变红褐色。
用去离子水漂洗,并拍照、记录酶带距离。
实验结果:
②过氧化物酶活性的测定
Ⅰ步骤
1.取上述的样品提取液2.5mL,定容至50mL刻度,备用(此处仅稀释萝卜与盘菜,水果均不稀释)。
2.取光径1cm比色皿3只,于1只中加入反应混合液3mL和磷酸缓冲液1mL,作为对照,另2只中分别加入反应混合液3mL和上述酶液各1mL(如酶活性过高可稀释之),立即开启秒表记录时间,于分光光度计上测量波长470nm下吸光度值,每隔1min读数一次(连读5min,取其平均值)。
Ⅱ数据处理
以时间为横坐标,该十分钟内每分钟对应的在470nm波长下的吸光值为纵坐标画图,得出该线斜率k,此斜率为每分钟吸光度变化价值。
1、每分钟内A470变化0.01为一个过氧化物酶活性单位(u)表示。
2、每分钟吸光度变化值表示酶活性大小,即
过氧化物酶活性=k/(0.01×W×t)
式中:
k为上图图线的斜率
W为苹果鲜重,g
t为反应时间,min
实验数据:
时间min
0
1
2
3
4
5
盘菜
0.146
0.681
0.958
1.139
1.244
1.292
萝卜
0.039
0、187
0.273
0.351
0.424
0.475
Abs变化值min
0→1
1→2
2→3
3→4
4→5
盘菜
0.535
0.227
0.181
0.105
0.048
萝卜
0.148
0.086
0.078
0.073
0.051
3.2实验方法概述
(一)、实验一:
2,6-二氯酚靛酚滴定法
氧化型染料在中性或碱性溶液中呈蓝色,在酸性溶液中呈红色。
成为还原型后为无色。
用氧化型染料来滴定还原型维生素C,当滴至全部还原型维生素C被氧化后,在稍滴一点呈微红色为终点。
滴定用去染料量与样品中还原型维生素C量成正比。
(二)、实验二:
为蒽酮比色法
原理单糖类遇到浓硫酸时,脱水生成糠醛衍生物,后者可与蒽酮缩合成蓝绿色的化合物,当糖的量在20-200mg范围内时,其呈色强度与溶液中糖的含量成正比,故可比色定量。
(三)、实验三:
考马斯亮兰法
考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式,红色和蓝色。
考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色,最大光吸收在465nm,当它与蛋白质结合后变为蓝色,最大光吸收在595nm。
在一定的蛋白质浓度范围内,蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比,通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
(四)、实验四:
①聚丙烯酰胺凝胶电泳法
凝胶电泳具有一般电泳的电场效应,即在一定pH的溶液中,样品分子由于解离或吸附,使自身带一定的电量,在相同的电场强度作用下,不同的样品分子因带不同的电性和电量,电泳时具有不同的泳动速度,使最终的迁移距离不同而分离。
凝胶电泳与其他电泳的重要区别是它除了有电场效应外,还具有分子筛效应,因凝胶是一种立体网状结构的物质,样品分子在通过凝胶网孔时受摩擦力等的作用,使体积小、形状为圆球形的样品分子受到的阻力小,移动较快,而体积大,形状不规则的样品分子受阻力大,移动较慢。
因此,凝胶电泳不但从分子带电情况的差别,而且还从分子大小、形状方面的差别来分离样品分子,具有很高的分辨力。
②比色法
在有过氧化氢存在下,过氧化氢酶能使愈创木酚氧化,生成茶褐色物质,该物质在470nm处有最大吸收,可用分光光度计测量470nm的吸光度变化测定过氧化氢酶活性。
3.3实验分析与讨论
实验一:
本次的实验整个过程较长,在整个过程中,若水浴加热时间不长,还原糖并未完全溶解,以及总糖的最终PH不为7都会给本实验的结果带来误差,而且样品1g很难控制的精确,也存在误差,在碾磨的过程中要充分的细,特别注意的是在测试总糖还原糖时也需要对照组,并且不能为蒸馏水,仪器也需要归位。
实验二:
如果测试要求很严格,可以在试剂中加入后5~20min内测定吸光度,因为在这段时间内颜色是最稳定的,比色反应需在1h内完成。
不可用手摸比色皿,可用塑料或玻璃比色皿,测定完后用95%乙醇将蓝色的比色皿杯洗干净。
试管干燥后不能直接加牛血清蛋白,因为此时的试管还是很热的,能导致蛋白质变性,使试管呈现出同一个颜色。
实验三:
在用琼脂封底的时候,温度不能太低了,会使封底不密,从而会漏,导致实验重做。
在制胶的过程中不能把TEMD加的太早,因为会很容易的凝结。
在制备样品的过程中,提取液要及时的放入冰箱中,因为酶在温度较高的条件下容易失活。
在点样的时候必须要小心,防止样品的扩散。
在接通电源的时候,正负两极不能弄反了
在剥离胶时要小心,并且要加入一定量的水,这样可以防止胶片破碎。
在取下玻璃板时,要记住先量蓝带到凹槽的距离。
实验四:
从实验的结果看出盘菜的过氧化物活力要明显的强于萝卜
不同的组的盘菜,萝卜数据也有很大的差别,说明植物生长条件的差异也会带来自生生理性的不同。
随着时间的延长,酶活力越来越弱
比色皿光滑面不能弄脏,否则会影响实验结果。
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