DNA的溶解度问题.docx
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DNA的溶解度问题.docx
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DNA的溶解度问题
乙醇沉淀法是一种常用的技术集中的盐在水溶液中的核酸(DNA或RNA)准备。
Thebasicprocedureisthatsaltandethanolareaddedtotheaqueoussolution,whichforcesthenucleicacidtoprecipitateoutofsolution.其基本做法是,加入盐和乙醇水溶液,这迫使核酸沉淀出的解决方案。
Theprecipitatednucleicacidcanthenbeseparatedfromtherestofthesolutionbycentrifugation.然后可以休息的解决方案,通过离心分离沉淀核酸。
Thepelletiswashedincold70%ethanolthenafterafurthercentrifugationsteptheethanolisremoved,andthenucleicacidpelletisallowedtodrybeforebeingresuspendedincleanaqueousbuffer.在寒冷的70%乙醇洗涤沉淀,然后再经过离心步骤乙醇被删除,并允许核酸颗粒干燥,然后在干净的缓冲溶液中悬浮。
Sohowdoesthiswork?
那么如何工作的呢?
Abitaboutsolubility…关于溶解度的位...
Firstweneedtoknowwhynucleicacidsaresolubleinwater.首先,我们需要知道为什么核酸是易溶于水。
Waterisapolarmolecule–ithasapartialnegativechargeneartheoxygenatomduetheunsharedpairsofelectrons,andpartialpositivechargesnearthehydrogenatoms(seethediagramontheright).水是极性分子-它有一个部分负电荷的氧原子附近,由于共用电子对,部分正电荷的氢原子(见右图)附近。
Becauseofthesecharges,polarmolecules,likeDNAorRNA,caninteractelectrostaticallywiththewatermolecules,allowingthemtoeasilydissolveinwater.极性分子,如DNA或RNA,因为这些费用,可以与水分子的静电相互作用,使他们能够很容易溶解于水。
Polarmoleculescanthereforebedescribedashydrophilicandnon-polarmolecules,whichcan'teasilyinteractwithwatermolecules,arehydrophobic.极性分子,因此可以被描述为亲水性和非极性分子,不能轻易与水分子相互作用,疏水。
Nucleicacidsarehydrophilicduetothenegativelychargedphosphate(PO3-)groupsalongthesugarphosphatebackbone.核酸是亲水性由于带负电荷的磷(PO3-)组沿糖磷酸骨架。
Theroleofthesalt…盐的作用...
Ok,sobacktotheprotocol.好吧,这样的协议。
Theroleofthesaltintheprotocolistoneutralizethechargesonthesugarphosphatebackbone.盐在协议中的作用是消除糖磷酸骨架上的收费。
Acommonlyusedsaltissodiumacetate.一种常用的盐是醋酸钠。
Insolution,sodiumacetatebreaksupintoNa+and[CH3COO]-.在溶液中,分解成Na+和[醋酸-醋酸钠。
ThepositivelychargedsodiumionsneutralizethenegativechargeonthePO3-groupsonthenucleicacids,makingthemoleculefarlesshydrophilic,andthereforemuchlesssolubleinwater.带正电的钠离子中和负电荷的核酸PO3组,分子远低于亲水性,因此多不溶于水。
Theroleoftheethanol…乙醇的作用...
TheelectrostaticattractionbetweentheNa+ionsinsolutionandthePO3-ionsaredictatedbyCoulomb'sLaw,whichisaffectedbythedielectricconstantofthesolution.钠离子在溶液中和PO3-离子之间的静电吸引力,库仑定律,这是解决方案的电介质常数的影响决定。
Waterhasahighdielectricconstant,whichmakesitfairlydifficultfortheNa+andPO3-tocometogether.水具有较高的介电常数,这使得它相当困难Na+和PO3-走到一起。
Ethanolontheotherhandhasamuchlowerdielectricconstant,makingitmucheasierforNa+tointeractwiththePO3-,shieldit'schargeandmakethenucleicacidlesshydrophilic,causingittodropoutofsolution.另一方面乙醇低得多的介电常数,使得它的Na+更容易互动,PO3-,它的电荷屏蔽,使核酸的亲水性,使其下降了解决方案。
Theroleoftemperature…温度的作用...
Incubationofthenucleicacid/salt/ethanolmixtureatlowtemperatures(eg-20or-80C)iscommonlycitedinprotocolsasnecessaryinprotocols.作为必要的协议,在协议中普遍提及的核酸/盐/乙醇的混合物在低温(如-20或-80C)的孵化。
However,accordingtoManiatisetal(MolecularCloning,ALaboratoryManual2ndEdition…2ndedition?
?
–Ineedtogetanewerversion!
),thisisnotrequired,asnucleicacidsatconcentrationsaslowas20ng/mLwillprecipitateat0-4Csoincubationfor15-30minutesoniceissufficient.然而,根据,曼尼阿蒂斯等(分子克隆实验手册第二版...第二版-?
!
我需要得到一个新的版本),这是不是必需的,因为20ng/mL低浓度核酸沉淀在0-4C,所以在冰上潜伏期为15-30分钟就足够了。
Thewashstepwith70%ethanol…用70%乙醇洗涤步骤...
ThisstepistowashanyresidualsaltawayfromthepelletedDNA.这一步是洗任何剩余的盐颗粒的DNA。
Afewtipsonnucleicacidprecipitation…核酸沉淀的一些技巧...
▪Choiceofsalt盐的选择
▪UseSodiumacetate(0.3Mfinalconc,pH5.2)forroutineDNAprecipitations使用常规的DNA沉淀醋酸钠(0.3M终浓度,pH值5.2)
▪UseSodiumchloride(0,2Mfinalconc)forDNAsamplescontainingSDSsinceNaClkeepsSDSsolublein70%ethanolsoitwon'tprecipitatewiththeDNA.使用DNA含有SDS自氯化钠保持SDS在70%乙醇中易溶,所以它不会沉淀的DNA样本,氯化钠(0,2米决赛浓度)。
▪UseLithiumChloride(0.8Mfinalconc)forRNA.使用氯化锂(0.8M终浓度)的RNA。
Thisisbecause2.5-3volumesofethanolshouldbeusedforRNAprecipitationandLiClismoresolubleinethanolthanNaAcsowillnotprecipitate,butbeware–chlorideionswillinhibitproteinsynthesisandDNApolymerasesoLiClisnogoodforRNAprepsforinvitrotranslationorreversetranscription.这是因为2.5-3乙醇卷应该被用于RNA沉淀和LiCl是比乙酸钠溶于乙醇,所以不会沉淀,但要小心-氯离子会抑制蛋白质的合成和DNA聚合酶,使氯化锂的RNAPREPS没有好的在体外翻译或反转录。
Inthesecases,useNaAc.在这种情况下,使用醋酸钠。
▪UseAmmoniumacetate(2Mfinalconc)fortheremovalofdNTPs,butdonotuseforpreparationofDNAforT4polynucleotidekinasereactionsasammoniumionsinhibittheenzyme.用于去除dNTPs浓度的醋酸铵(2M终浓度),但不使用T4聚核苷酸激酶反应制备的DNA铵离子抑制酶。
▪Toincreasetheyieldinprecipitationsoflowconcentrationorsmallnucleicacidpieces(lessthan100nucleotides)在低浓度或小核酸件(少于100个核苷酸)的降水以增加产量
▪AddMgCl2toafinalconcentrationof0.01M氯化镁的终浓度为0.01M
▪Increasethetimeofincubationicebeforecentrifugationto1hour.潜伏期冰离心前的时间增加至1小时。
Phenol/ChloroformExtraction酚/氯仿抽提
andEthanolPrecipitation和乙醇沉淀
DESCRIPTION描述
Phenol/ChloroformExtraction酚/氯仿抽提
OneofthemostcommonlyusedandusefulmethodsforisolationandconcentrationofDNAandRNAfromaqueoussolutionsisphenol/chloroformextractionfollowedbyethanolprecipitation.最常用的和有益的,从水溶液中的DNA和RNA的分离和浓度的方法之一是酚/氯仿抽提,乙醇沉淀。
Duringorganicextraction,proteincontaminantsaredenaturedandpartitioneitherwiththeorganicphaseorattheinterfacebetweenorganicandaqueousphases,whilenucleicacidsremainintheaqueousphase.在有机萃取,蛋白质污染物变性和分区与有机相或有机相和水相之间的界面,而留在水相中的核酸。
Phenolusedinthisprotocolisbufferedtopreventoxidizedproductsinthephenolfromdamagingthenucleicacids.在这个协议中使用的苯酚缓冲,以防止破坏核酸在苯酚氧化的产品。
Beawarethatphenolcancauseseverechemicalburnsonskinandwilldamageclothing.要知道,酚可引起严重的化学烧伤,皮肤上,会损伤衣物。
Weargloves,safetyglasses,andalaboratorycoatwhenworkingwithphenol.与苯酚工作时戴手套,安全眼镜,实验室大衣。
Inthemethodpresentedhere,phenol/chloroform(50%/50%;v/v)isrecommendedforextraction.建议在这里提出的方法,酚/氯仿(50%/50%V/V)提取。
Inmostcases,thismixtureprovide在大多数情况下,这种混合物提供goodproteindenaturationandatighterinterphasebetweentheaqueousandorganicphases.良好的蛋白质变性和水相和有机相之间的更紧密相间。
Ifthereisaproblemwithexcessivefoamingduringtheextraction,isoamylalcoholcanbeaddedtoobtainanorganiccompositionofphenol/chloroform(50%/49%)/isoamylalcohol(I%).提取过程中过多的泡沫如果有一个问题,异戊醇可以增加获得的酚/氯仿(50%/49%)/异戊醇(%)的有机组成。
ConventionalEthanolPrecipitation传统的乙醇沉淀
Duringtheethanolprecipitation,saltsandothersolutessuchasresidualphenolandchloroformremaininsolutionwhilenucleicacidsformawhiteprecipitatethatcan,easilybecollectedbycentrifugation.在乙醇沉淀,盐和其他溶质,如残余苯酚和氯仿溶液中保持,而核酸形成白色沉淀物,可以很容易地通过离心收集。
Iftheaqueousvolumeislessthan450pL,thereactioncanbeperformedinamicrocentrifugetube.如果水的体积小于450PL,反应可在离心管中。
Thisisthemostconvenientformatforperformingorganicextractionsandethanolprecipitations.这是最方便的格式进行有机提取物和乙醇沉淀。
Forlargervolumes,multiplemicrocentrifugetubescanbeused,orthereactioncanbescaledup.对于体积较大,可以使用多种离心管,可以扩展或反应。
Whenscalingthereactionup,usetightlycappedpolypropylenetubesforthephenol/chloroformextraction,andcentrifugeat2500rpmatroomtemperaturetoresolvephases.Polystyrenetubescannotwithstandthephenol/chloroform.Ethanolprecipitationcanbeperformedin15-or30-mLCorextubes,andtheprecipitatecollectedbycentrifugationat10,000xgfor15minat4OC.当缩放的反应了,使用的酚/氯仿提取,并离心机盖紧聚丙烯管在2500在室温下转速来解决阶段聚苯乙烯管能不能承受的酚/氯仿乙醇沉淀可以将在15个执行-。
。
或30-毫升的Corex管,沉淀15分钟,在4℃离心收集10,000XG。
ItisrecommendedthatCorextubesbeacidwashedbeforeusebyimmersionin50%nitricacidfor1hr,followedbythoroughrinsingindistilledwater,andautoclavingfor20min.据建议,Corex公司管是使用在50%硝酸浸泡在蒸馏水彻底清洗,高压灭菌20分钟,1小时前洗酸。
Inourhands,nucleicacidfragmentsandoligonucleotideslongerthan15nucleotidescanbeefficientlyprecipitatedusingthisprotocol.在我们的手,核酸片段和寡核苷酸超过15个核苷酸可以有效地沉淀,使用此协议。
Forefficientprecipitation,thenucleicacidconcentrationshouldbeatleast10gg/mL.为了有效降水,核酸浓度应该是至少10GG/毫升。
Lowerconcentrationsofnucleicacidscanbeprecipitated,buttherecoverymaynotbequantitative.可以沉淀核酸的浓度较低,但经济复苏可能不定量。
Toprecipitatelowernucleicacidconcentrations,incubatetheprecipitateat-20'C(orondryice)for4hrtoovernight,andcentrifugefor30mintocollecttheprecipitate.沉淀核酸浓度较低,在-20“C”(或干冰)孵育4小时至过夜,离心30分钟,收集沉淀的沉淀。
Alternatively,nanogramquantitiesofnucleicacidcanbeefficientlyprecipitatedbyaddingyeasttRNAcarriertothesolutiontoobtainanucleicacidconcentrationof10@g/mLbeforeinitiatingtheextractionandprecipitationprocedure.另外,可以有效地沉淀核酸纳克数量加入酵母tRNA载波解决方案前发起的提取和降水过程,获得了10克/毫升的核酸浓度。
ThepresenceofTRNAcarrieristypicallynotaproblem,exceptwhenthecarrierwillinterferewithsubsequentenzymaticmanipulationsofthesample(eg,ifaDNAfragmentwillbeend-labeledwithT4polynucleotidekinase).tRNA的载体的存在通常是没有问题的,除承运人时,会干扰随后的酶样品的操作(例如,如果将DNA片段,用T4多核苷酸激酶末端标记)。
Therecommendedsaltformostroutineapplicationsofthismethodis0.3Msodiumacetate(finalconcentration),whichismoresolubleinethanolthan0.3Msodiumchlorideandthereforelesslikelytoprecipitatewiththenucleicacidsample.这种方法最常规应用的建议盐0.3M醋酸钠(终浓度),这是更大于0.3m氯化钠溶于乙醇,因此不太可能与核酸样品沉淀。
Forsamplescontainingsodiumdodecylsulfate(SDS),therecommendedsaltis0.2Msodiumchloride,sincetheSDSissolubleinethanolundertheseconditions.对于含有十二烷基硫酸钠(SDS)的样品,建议的盐是氯化钠0.2mol以来,SDS是在这些条件下易溶于乙醇。
Forremovaloftriphosphates(labeledorotherwise),2Mammoniumacetateisrecommendedinsteadof0.3Msodiumacetate,sincetriphosphatesarelesslikelytoprecipitateundertheseconditions.2M醋酸铵为三磷酸去除(或其他标记),而不是建议的0.3M醋酸钠,因为三磷酸沉淀在这些情况下是不太可能的。
Ammoniumacetateisnotrecommendedifthenucleicacidsamplewillbe5'phosphorylated
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