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基因工程2资料
第四章核酸的定量和纯度检测
提取的总DNA、RNA或载体DNA,外源目的DNA片段,必须对其浓度、纯度、构型、分子量大小等基本情况进行了解,以下几种方法从不同角度对DNA或RNA进行了鉴定。
第一节紫外光谱分析法
核酸的最大吸收波长为260nm,蛋白质为280nm,在260nm波长时,用标准样品测得每毫升l微克DNA钠盐溶液的吸光度值为0.02,即在1OD值相当于双链DNA浓度为50ug/ml,单链DNA或RNA为40ug/ml,单链寡聚核苷酸的含量为30ug/ml,可以据此来计算核酸样品的浓度。
DNA浓度计算:
根据经验数据,若OD260=l时,dsDNA的浓度为50微克/毫升,假如质粒样品pBR322稀释500倍,测得光吸收值为0.025,则该样品pBR322浓度为50*0.025*500=625微克/毫升。
分光光度法不但能确定核酸的浓度,还可通过测定在260nm和280nm的OD值的比值(OD260/OD280)估计核酸的纯度。
纯净DNA的比值为1.8,纯净RNA的比值为2.0。
若DNA的比值高于1.8,说明DNA样品中的RNA尚未除尽,若样品中含有酚和蛋白质将导致比值降低,此时,可通过苯酚-氯仿-异戊醇方法抽提后再检测,以排除蛋白质的影响。
270nm存在高吸收表明有酚的干扰。
优点:
使用UⅤ-240紫外分光光度计测定DNA的方法简便、快速。
注意的问题:
1)用UⅤ-240可以通过260nm和280nm的OD值的比值(OD260/OD280)估计核酸的浓度和纯度,但不能区分DNA的超螺旋、开环、线状三种构型,也不能区分染色体DNA。
由于测定OD260时,难于排除RNA,染色体DNA,以及DNA解链的增色效应等因素,因此测得的数据往往比实际浓度偏高。
2)用UⅤ-240,有因样品槽大,测定用量较多的缺点,但对于测浓度较高的样品,特别是测定寡聚核苷酸的浓度其效果甚佳。
其他DNA多数选用琼脂糖凝胶法进行鉴定。
3)紫外分光光度法只能用于测定浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液,对浓度更小的样品,可采用荧光分光光度法。
第二节溴化乙锭-标准DNA浓度比较法测定DNA浓度
DNA本身不产生荧光,但荧光染料溴化乙锭(EB)嵌入碱基对之间后,可在紫外线激发下发出红色荧光。
不同浓度的DNA溶于一定浓度的溴化乙锭溶液中,在紫外灯下所发射荧光的强度与核酸含量成正比,使用一系列已知浓度的DNA溶液作标准对照,可比较出被测DNA样品的浓度。
特点:
仪器设备与操作都很简单,省时,配制一套标准浓度的DNA样品与试剂存于-20℃,随时可进行测定比较。
克服了UⅤ-240用量大的缺点,只需lul的用量,就可测出lng的DNA样品。
适合于测定经过分离纯化后的DNA片段浓度,为DNA的重组连接提供浓度参数。
在基因操作中,对于DNA含量较少,特别是要对分离纯化后的DNA片段的浓度进行测定,用此比较法最为合适。
此法直接简便,测定量仅需0.5~1微升就能比较出确切浓度,灵敏度可达l~5ng。
影响实验结果的因素:
1)本实验对样品中含有的染色体DNA、RNA以及质粒DNA的三种构型无法区分;若待测样品不纯,测得的浓度比实际浓度肯定偏高。
2)实验采用比较法,操作者的目测误差也影响准确性。
3)DNA浓度大于20ng/ul以上时浓度误差较大,需要样品稀释到合适的浓度才能进行比较。
第三节DNA的凝胶电泳
带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳(electrophoresis)。
各种生物大分子在一定pH条件下,可以解离成带电荷的离子,在电场中会向相反的电极移动。
电泳技术是l9世纪初发明的,人们采用各种材料作为支持电泳介质,其中以琼脂糖和聚丙烯酰胺为支持介质的凝胶电泳最为突出。
凝胶电泳的原理比较筒单。
当一种分子被放置在电场当中时,它们就会以一定的速度移向适当的电极。
这种电泳分子在电场作用下的迁移速度,叫做电泳的迁移率,它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。
即电场强度越大,电泳分子所携带的净电荷数量越多,其迁移的速度也就越快,反之则较慢。
由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质,如琼脂糖凝胶和聚丙烯酞胺凝胶等,电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。
已知摩擦系数是分子的大小、极性及介质黏度的函数,因此根据分子大小的不同、构型或形状的差异,以及所带的净电荷的多寡,便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。
应用凝胶电泳技木分离DNA片段的基本原理:
在一定生理条件下,核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团是呈离子化状态的,DNA和RNA的多核苷酸链可叫做多聚阴离子,核酸分子在电场中向正电极方向迁移。
由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。
在一定的电场强度下,DNA分子的这种迁移速度(亦即电泳的迁移率)取决于核酸分子本身的大小和构型。
分子量较小的DNA分子比分子量较大的DNA分子具有较紧密的构型,其电泳迁移率快,而且比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快些。
一、水平式琼脂糖凝胶电泳检测
琼脂糖是一种从红色海藻产物琼脂中提取而来的线性多糖聚合物。
琼脂糖是一种直链多糖,它由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖的残基交替排列组成的线型多聚糖。
由于链状琼脂糖分子相互以氢键交联,因此与琼脂一样能形成凝胶。
琼脂糖带有亲水性,不含有带电荷的基团,不引起DNA变性,又不吸附被分离物质,因此它是一种很好的凝胶剂。
当琼脂糖加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质,其密度是由琼脂糖的浓度决定的。
有两种不同类型的琼脂糖凝胶,一种是常熔点的,另一种是低熔点的(熔点为62~65℃的琼脂衍生物),它一旦熔解,便可在37℃持续保持液体状态达数小时之久,而在25℃下也可持续保持液体状态约10分钟。
经化学修饰的低熔点(LMP)的琼脂糖在结构上比较脆弱,因此在较低的温度下便会熔化,可用于DNA片段的制备电泳,但价格却相当昂贵。
原理:
溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光,当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时,琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物,使DNA发射的荧光增强几十倍。
而荧光的强度正比于DNA的含量,如将已知浓度的标准样品作琼脂糖凝胶电泳对照,就可比较出待测样品的浓度。
若用薄层分析扫描仪检测,则可精确地测得样品的浓度。
电泳后的琼脂糖凝胶块直接在紫外灯照射下拍照,只需要5~10ngDNA,就可以从照片上比较鉴别。
如肉眼观察,可检测到0.01~0.1ug的DNA。
在凝胶电泳中,DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比关系。
质粒DNA样品用单一切点的酶酶切后与已知分子量大小的标准DNA片段进行电泳对照,观察其迁移距离,就可获知待测样品的分子量大小。
凝胶电泳不仅可以分离不同分子量的DNA,也可以鉴别分子量相同,但构型不同的DNA分子。
一般情况下,超螺旋型(SC)迁移速度最快,其次为线状(L)分子,最慢的为开环状(OC)分子。
当提取到的质粒DNA样品中还有染色体DNA或RNA,在琼脂凝胶电泳上也可以分别观察到电泳区带,由此可分析样品的纯度。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应,前者由分子所带净电荷量的多少而定,后者则主要与分子大小及其构型有关。
DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷,在电场中向正极移动,在用电泳法测定DNA分子大小时,应当尽量减少电荷效应。
增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应,使分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度的差异所决定,提高分辨率。
同时适当减低电泳时的电压,也可使分子筛效应相对增强而提高分辨率。
影响琼指糖凝胶电泳DNA迁移速率的因素:
1.DNA的分子大小:
线状双链DNA分子在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目以10为底的对数值成反比。
分子越大,则摩擦阻力越大,也越难于在凝胶孔隙中蠕行,因而迁移得越慢。
2.琼脂糖浓度:
一个给定大小的线状DNA片段,其迁移速率在不同浓度的琼脂糖中各不相同。
DNA电泳迁移率()的对数与凝胶浓度()成线性关系,可用如下等式表示:
lg=lg0-Kr,其中0为DNA的自由电泳迁移率;Kr是回归系数,是一个与凝胶的性质、迁移分子的形状和大小有关的常数。
在大孔径的琼脂糖凝胶(即琼脂糖含量低的凝胶)中,凝胶对不同大小的DNA分子,其阻滞程度差异不大,而DNA分子的迁移率更多地依赖于分子的净电荷,因此对较小的DNA分子群得不到很好的分离效果。
如果增加琼脂糖凝胶的浓度,可在一定的程度上降低电荷效应,使DNA分子迁移速度的差异主要由分子受凝胶阻滞程度的差异所决定。
但高浓度的琼脂糖凝胶电泳,所需时间长,因此通常根据待测分子量范围选择合适浓度的凝胶。
也要根据每次电泳的不同要求,选择不同大小的电泳槽与合适的条件。
3.DNA的构象:
分子量相同的超螺旋型、带切口环状及线状DNA通过凝胶时速度不一。
这三种DNA的相对迁移率主要取决于凝胶的琼脂糖浓度,也受电流强度、缓冲液的离子强度及超螺旋型DNA超螺旋度的影响。
在某些条件下超螺旋型DNA迁移速率比线型DNA快;在另一些条件下则恰恰相反。
4.所加电压:
在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。
随着电场强度的增加,高分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,不再与电压成正比。
因此,随着电压的增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围缩小。
要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不应超过5V/cm。
5.电场方向:
如果电场方向保持不变,则大于50~100kb的DNA分子在琼脂糖凝胶上的迁移速率相同。
如果电场方向改变,则DNA分子被迫改变路径。
由于DNA分子越大,为适应新的电场方向而重新排列所需的时间越长,因此可以通过脉冲电场凝胶电泳来分辨极大的DNA分子(达到10000kb)。
6.碱基组成与温度:
DNA在琼脂糖凝胶中的电泳行为受DNA的碱基组成或凝胶电泳温度的影响不明显。
不同大小的DNA片段的相对迁移率在4℃与30℃之间不发生改变。
电泳一般在室温下进行。
但浓度低于0.5%的琼脂糖凝胶和低熔点琼脂糖凝胶较为脆弱,最好在4℃下电泳。
7.嵌入染料的存在:
荧光染料EB用于检测琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA,它会使线状DNA的迁移率降低15%。
染料嵌入到堆积的碱基对之间,并拉长线状和带切口的环状DNA,使其刚性更强。
8.电泳缓冲液的组成:
电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。
在没有离子存在时(如凝胶中未加缓冲液),电导率最小,即使DNA还能移动一点的话,也很慢。
在高离子强度的缓冲液中(如误加了10倍电泳缓冲液),电导很高并明显产热。
最坏的情况是引起凝胶熔解而DNA发生变性。
有几种不同的缓冲液可用于天然双链DNA的电泳。
这些缓冲液含EDTA(pH8,0)和Tris-乙酸(TAE)、Tris-硼酸(TBE)或Tris-磷酸(TPE)。
其浓度约为50mmol/L(pH7.5~7.8)。
电泳缓冲液通常配制成浓缩液,贮存于室温。
最常用的缓冲液是TAE。
但它的缓冲容量相当低,长时间电泳会使其缓冲容量丧失殆尽(阳极呈碱性,阴极变成酸性)。
在进行高压、长时间的电泳时,更新缓冲液或在两槽之间进行缓冲液循环是可取的。
TPE和TBE比TAE成本稍高,但它们的缓冲容量明显较高。
双链线状DNA片段在TAE中的迁移速率比在TBE或TPE中快将近10%,但这些系统的分辨能力几乎相同,只是超螺旋DNA在TAE中的分辨率要比在TBE中更好。
核酸电泳常用的指示剂有两种:
溴酚蓝,呈蓝紫色,分子量为670道尔顿,在不同浓度凝胶中迁移速度基本相同,分子筛效应小,近似于自由电泳,故被普遍用作指示剂。
在0.6%、1%、2%的琼脂糖凝胶电泳中,溴酚蓝的迁移率分别与lkb、0.6kb和0.15kb的双链线性DNA片段大致相同。
二甲苯腈,呈蓝色,分子量为554.6道尔顿,携带的电荷量比溴酚蓝少,在凝胶中迁移率比溴酚蓝慢。
根据分离样品中DNA分子的大小,可以参照指示剂溴酚蓝和二甲苯腈的迁移情况决定是否停止电泳。
指示剂一般加在电泳上样缓冲液中,为了使样品能沉入胶孔,还要加入适量的蔗糖、聚蔗糖400或甘油以增加密度。
在凝胶电泳中,把含有DNA分子的凝胶浸泡在EB溶液中,或是将EB直接加到凝胶介质中,染料便会在一切可能的部位同DNA分子结合,在紫外光的照射下,DNA分子通过放射荧光而变成可见的谱带。
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
聚丙烯酰胺凝胶电泳也是一种凝胶电泳检测DNA的方法,分辨率最高,只相差一个bp的DNA片断也能分开,且可以容纳较大容量的DNA。
但此法只能分离小于500bp以下的双链DNA片段,琼脂糖凝胶电泳虽然分离DNA的范围较广,但对200bp以下的小片段的分离却很因难。
因此将这两种方法互补起来,就能很好地完成由5bP到50kb的双链DNA的分离、鉴定和纯化的工作。
基本原理:
过硫酸胺(AP)与TEMED(N,N,N’N’-四甲基乙二胺)是单体丙烯酰胺(Acr)的催化剂与诱导剂。
它们使单体丙烯酰胺聚合成一串串长链。
当溶液中的N,N’-亚甲基双丙烯酰胺参与聚合反应时,长链与长链之间就交联成凝胶,链长与交联度就决定了凝胶的孔径,这种孔径与琼脂糖凝胶的密度不同,只有DNA的小片段能进入凝胶内,在电泳场作用下进行分离。
DNA各片段在其相应的胶的位置上,然后通过溴化乙锭染色后,将凝胶移入紫外灯的照射下,根据凝胶中已知浓度的标准DNA各片段的大小与荧光亮度的比较,测出未知样品的浓度与分子量大小。
如果需要凝胶中那一片段,可以从胶上切割下来进行纯化,这种纯化的DNA纯度极高。
与琼脂糖凝胶一样,聚丙烯酰胺凝胶可以灌制成各种形状、大小和孔隙度,并在许多种不同的装置里进行电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳根据电泳样品的电荷、分子大小及形状的差别分离物质。
这种介质既具有分子筛效应,又具备静电效应,分辨力高于琼脂糖凝胶电泳,适用于低分子量蛋白质、寡聚核苷酸的分离和DNA的序列分析。
聚丙烯酰胺凝胶电泳可以容纳相对大量的DNA,其不足之处在于:
与琼脂糖凝胶相比,凝胶的制备和电泳都比更为费事。
聚丙烯酰胺凝胶一律是进行垂直装置在恒定电场下电泳,根据分离的需要,其长度可以在10~100cm之间。
虽然聚丙烯酰胺凝胶的灌制比琼脂糖凝胶繁杂,但以下几种优点是琼脂糖凝胶所不具备的:
1)分辨率极高,在同一DNA混合物中,即使最大的片段比最小的片段长500倍(如1bp与500bp)也能很好地分离;
2)比琼脂糖凝胶的载样量大,在lcmXlmm的胶孔中能上样到10ug的DNA样品,而分辨率并无明显下降;
3)回收的DNA样品纯度极高,可用于要求非常严格的实验,如转基因动物实验;
4)在聚丙烯酰胺凝胶分子的交联网状结构中,带有酰胺侧链的C-C聚合物不带或少带离子侧链基团;
5)聚丙烯酰胺凝胶无色透明,比琼脂糖凝胶的紫外线吸收低,抗腐蚀性强,机械强度高,韧性好。
影响DNA片段分离纯化的因素:
尽管聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖凝胶有以上优点,但还是有多种因素影响DNA分子条带分离纯化的效果,因此在聚丙烯酰胺凝胶电泳时有如下几个方面要注意的:
1)电泳中气泡的影响:
2)点样孔的阻塞影响:
3)电泳条件的影响:
4)最少上样量的估计:
5)DNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果分析。
常用的丙烯酰胺凝胶有非变性与变性两种:
1)用于分离和纯化双链DNA片段的非变性聚丙烯酰胺凝胶
2)用于分离、纯化单链DNA的变性聚丙烯酰胺凝胶
三、脉冲电泳检测
琼脂糖电泳是根据DNA分子量大小来筛选DNA分子的一种方法。
琼脂糖浓度低,胶的孔径大,则可以允许通过的DNA分子也越大,然而当DNA分子太大时,实际上已无法通过胶孔,所有超过一定大小的线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速率相同,这时,琼脂糖的分离能力达到了极限,而琼脂糖凝胶的孔径也不是可以无限增大的,且随着胶浓度的降低,胶越来越软易碎而难以操作。
一般来说,普通的琼脂糖凝胶电泳只能对50kb以下的DNA片段进行分离分析。
但是,即使低等真核生物的一条染色体就有7000kb,高等真核生物的染色体更大,一个基因有几千kb,怎么才可能尽量完整地来研究这些大段的DNA呢?
为了解决这一问题,1984年,发展了脉冲电泳技术。
1.原理:
DNA分子在两个交替改变的电场力作用下,不断地改变自己的形状,当它由“线团”状变成“束”状时,就有可能进入凝胶。
在电场力的作用下,象蛇一样地爬行,这时,大分子移动慢,小分子移动快。
当电场发生变化时,DNA分子又再次改变自己的形状,沿着新的电场方向移动,在这一过程中,大分子较小分子要困难些,所化的时间也长一些。
由于上述两个因素,再加上小分子DNA在凝胶孔中移动时受到的摩擦力也比大分子小,因此整个电泳过程的总效应是小分子移动快,大分子移动慢。
一般的琼脂糖凝胶中:
DNA分子移动距离与其分子长度(bp)的对数成反比。
但是脉冲电泳不符合这一规律。
由于移动过程与分子改变自身形状的时间有关,脉冲长则更适合于大分子的分离,一般用长脉冲、低电压分离较大的分子;短脉冲高电压分离小的分子,琼脂糖的浓度也可随所分离的DNA分子的大小而作相应的变化。
脉冲电泳的诞生,使可以分离的DNA分子的上限大大提高,最大可达9000kb,使人类有可能对一些大的DNA片段进行分析研究。
脉冲电场凝胶电泳分辨力的极限取决于几个因素,包括:
1)两个电场的均一程度。
2)电脉冲的绝对长度。
3)用于产生两个电场的电脉冲长度的比例。
4)两个电场与凝胶所成的角度。
5)两个电场的相对强度。
2.用于脉冲电泳的DNA的制备(包块法):
为避免大分子DNA在抽提过程中受到剪切,可以在琼脂糖块或小珠中进行细胞原位裂解。
由于琼脂糖块更有效,是目前应用最多的抽提大分子DNA的方法。
此法使细胞裂解,蛋白酶消化,DNA分子酶解等整个过程在一定浓度的琼脂糖块中进行,避免了液相中和有机试剂中的剧烈处理,保证DNA分子受到最小的机械损伤,被用于哺乳动物人和其他真核生物的总DNA的提取。
琼脂糖块可以直接加到脉冲电场凝胶的加样孔中,也可以在上样前使之熔化。
第五章分子克隆中所用酶
通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键,从而导致核酸分子多核苷酸发生水解断裂的蛋白酶叫做核酸酶。
其中专门水解断裂RNA分子的叫做核糖核酸酶(RNase),而特异水解断裂DNA分子的则叫做脱氧核糖核酸酶(DNase)。
核酸酶按其水解断裂核酸分子的不同方式,可分为两种类型:
一类是从核酸分子的末端开始,一个核苷酸一个核苷酸地消化降解多核苷酸链,叫做核酸外切酶(exonuclease);另一类是从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段,叫做核酸内切酶(endonuclease)。
第一节核酸内切限制酶
核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列,并由此切割DNA双链结构的酶。
主要是从原核生物中分离纯化出来的。
根据1994年美国出版的《分子生物学百科全书》的统计数字,仅Ⅱ型核酸内切限制酶一项就已从各种不同的微生物当中,分离出了2300种以上、可识别230种不同的DNA序列。
在核酸内切限制酶的作用下,侵入细菌的“外源”DNA分子便会被切割成不同大小的片段,而细菌自己固有的DNA由于修饰酶(通常是一种甲基化酶)的保护作用,则可免受限制酶的降解。
目前已经鉴定出3种不同类型的核酸内切限制酶,即Ⅰ型酶、II型酶和III型酶。
最初在限制-修饰系统中发现的限制酶属于第Ⅰ型限制酶,它们的切割位点是随机的,至少距识别位点1000bp。
第Ⅲ型限制酶的切割位点距识别序列3'端为24~26bp。
第Ⅱ型限制酶的切割位点一般在识别序列上或与之靠近,而且具有序列特异性,故在基因克隆中有特别广泛的用途。
Ⅱ型核酸内切限制酶具有3个基本的特性:
①在DNA分子双链的特异性识别序列部位切割DNA分子,产生链的断裂;②2个单链断裂部位在DNA分子上的分布通常不是彼此直接相对的;③断裂结果形成的DNA片段往往具有互补的单链延伸末端。
限制酶的命名是根据分离出该酶的微生物的学名进行的,通常为3个字母:
第一个字母大写,来自微生物属名的第一个字母;第二、第三个字母小写,来自微生物种名的头两个字母。
如果该微生物有不同的变种和品系,则再加一个大写的来自变种或品系的第一个字母。
从同一种微生物中发现的几种限制酶,则根据其被发现和分离的顺序用I、Ⅱ、III等罗马数字表示。
例如,从淀粉液化芽孢杆菌(Bacillusamyloliguefaciens)H株中发现并分离的第一种限制酶,被称为BamHI。
绝大多数的Ⅱ型核酸内切限制酶,都能够识别由4一8个核苷酸组成的特定的核昔酸序列,我们称这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。
一般说来,同一种DNA分子中,识别序列短的出现概率大,识别序列长的出现概率小。
原则上有n个核苷酸的识别序列的出现概率为1/4n。
如Sau3A的识别序列只有4个核苷酸GATC,则间隔256(44)个核苷酸就有一次机会出现这个识别序列;NotI的识别序列有8个核苷酸GCGGCCGC,则须间隔65536(48)个核苷酸才有一次机会出现这个识别序列。
因此要获得不同长度的DNA片段,就得选用识别序列长短不同的限制性核酸内切酶进行切割。
但实际上未必所有的限制性核酸内切酶识别序列的出现概率都符合这样的规律。
往往是富AT的识别序列在富AT的DNA分子中出现的概率高,在富GC的DNA分子中出现的概率低;而富GC的识别序列在富AT的DNA分子中出现的概率低,在富GC的DNA分子中出现的概率高。
由于那些长的识别序列和富GC或富AT的识别序列在DNA分子中出现的概率很低,所以把这些识别序列相应的限制性核酸内切酶称为稀切酶(rarecuttingenzymes)。
为了获得大的片段,有时须采用稀切酶切割。
已发现多种限制性核酸内切酶属稀切酶,如富GC识别序列的稀切酶有ApaI(GGGCCC)、BglⅠ(GGCN5GCC)、BssHII(GCGCGC)、EclXI和XmaIII(CGCGCG)、KspI和SacII(CCGCGG)、NarI(GGCGCC)和SmaI(CCCGGG);富AT识别序列的稀切酶有AsnI和AseI(ATTAAT)、DraI(TTTAAA)和SspI(AATATT)。
有的限制性核酸内切酶可识别两种以上的核苷酸序列。
如AccI既可识别GTATAC,又可识别GTCGAC;DdeI可识别的核苷酸序列有CTAAG、CTTAG、CTGAG和CTCAG。
这样的限制性核酸内切酶为获得多种酶切片段提供了方便。
有一些来源不同的限制酶能识别同样的核苷酸靶子序列,这类酶称为同裂酶(isoschizomers)。
同裂酶产生同样的切割,形成同样的末端。
“完全同裂酶”能识别和切割完全相同的序列,如HindIII与HsuI,“不完全同裂酶”虽能识别相同序列,但切割方式不同,如XmaI和SmaI。
某些限制酶的识别序列中存在简并现象,即识别序列中的个别碱基可以允许一定程度的替换。
有些酶来源各异,识别的靶子序列也各不相同,但都产生出相同的黏性末端,称为同尾酶(isocaudamer)。
常用的限制酶BamHI、BclI、BglⅡ、Sau3AI和XhoⅡ就是一组同尾酶,它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的黏性末端。
由同尾酶所产生的DNA片段是能够通过其黏性末端之间的互补作用而彼此连接起来。
但由一对同尾酶分别产生的黏性末端共价结合形成的位点,称为“杂种位点”(hybridsite),一般是不能再被原来的任何一种同尾酶所识别。
亦有例外情况,如由Sau3AI和BamHI同尾酶形成的杂种位点,对Sau3AI仍然是敏感的,但已不再是BamHI的靶子位点。
总结限制性内切酶的切割方式:
根据切割位点相对于对称轴的位置而言有三种,在对称轴5'侧切割产生5'粘端,在对称轴的3'侧切割产生3'粘端,在对称轴处切割产生平端。
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