原粮霉菌毒素检测手册.doc
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原粮霉菌毒素检测
实
用
操
作
手
册
江苏省微生物研究所有限公司编制
二○○六年四月·无锡
一、样品的采集、制备及保存
1、样品的采集:
①样品的概念:
按照规定的方法及使用适当的工具,采取一定数量的具有代表整体质量的部分,以供分析检验用,该部分叫做样品。
②采样的过程:
检样原始样品平均样品试验样品(试样)。
③采样的类型:
选择性采样;客观性采样。
④采集后的处理:
附上标签,注明名称、日期、数量、采样地点及方法,签封并登记。
2、样品的制备:
原始样品的分取、粉碎、混匀、缩分的过程。
注意防止成份的变化及交叉污染。
常用的制备方法:
①机械混匀法(四分法、分样器法);
②粉碎、过筛法;
③研磨法;
④搅拌法。
3、样品的保存:
①当天采集的样品原则上当天测。
②使用的容器应用2%的次氯酸钠水溶液浸泡后,再洗干净晾干或烘干备用。
③一般样品检验结束后保留样品1个月,以备复查。
二、待测液的制备
1、黄曲霉毒素B1待测液的制备:
①称量:
准确称取5.0g均匀的粉碎样品;
②提取:
用甲醇水(1:
1)溶液25ml来振荡提取半小时,过滤;
③稀释:
取滤液1ml,用甲醇水(1:
1)进行稀释,记好稀释倍数;
④储藏:
稀释好的待测液直接进行检测或具塞小试管封存,放置冰箱中,避光保存,隔天检测(冰箱中放置最好不超过两天)。
2、呕吐毒素(DON)待测液的制备:
①称量:
准确称取5.0g均匀的粉碎样品;
②提取:
用甲醇水(1:
9)溶液25ml来振荡提取半小时,过滤;
③稀释:
取滤液1ml,用甲醇水(1:
9)进行稀释,记好稀释倍数;
④储藏:
稀释好的待测液直接进行检测或具塞小试管封存,放置冰箱中,避光保存,隔天检测(冰箱中放置最好不超过两天)。
3、玉米赤霉烯酮(ZEN)待测液的制备:
①称量:
准确称取5.0g均匀的粉碎样品;
②提取:
用甲醇水(7:
3)溶液20ml来振荡提取半小时,过滤;
③稀释:
取滤液1ml,用甲醇水(7:
3)进行稀释,记好稀释倍数;
⑤储藏:
稀释好的待测液直接进行检测或具塞小试管封存,放置冰箱中,避光保存,隔天检测(冰箱中放置最好不超过两天)。
三、大量样品的集中初筛:
1、黄曲霉毒素B1定性测定法。
注意点:
①稀释:
取滤液1ml,用甲醇水(1:
1)进行稀释,记好稀释倍数;依据国家对小麦(玉米、花生)中限量标准来进行适当稀释。
比如:
玉米中国家标准最大允许量为20ug/kg,那么滤液应稀释4倍。
(允许量除以5)
②试剂的配制:
酶标抗原,洗涤液。
③实验设计:
截取相当数量的反应孔;设定三个对照孔(仪器调零孔,阴性对照孔,阳性对照孔(1.0ng/ml));其余为样品孔(一般一次性测21个样品,以防操作时间过长带来的误差)。
④显色后先目测,比较样品孔和阳性孔的颜色,若阳性孔的颜色深于样品孔,则样品孔的浓度大于1.0,样品超标。
⑤加终止液,酶标仪测出吸光度,作为原始记录。
2、呕吐毒素(DON)定性测定法。
注意点:
①稀释:
取滤液1ml,用甲醇水(1:
9)进行稀释,记好稀释倍数;依据国家对小麦(玉米、大麦)中限量标准来进行适当稀释。
比如:
国家标准最大允许量为1000ug/kg,那么滤液应稀释2倍,与浓度为100ng/ml的标准点进行比较。
②试剂的配制:
酶标二抗,洗涤液,DON单克隆抗体。
②实验设计:
截取相当数量的反应孔;设定2个对照孔(阴性对照孔(0ng/ml),阳性对照孔(100ng/ml));其余为样品孔(一般一次性测21个样品,以防操作时间过长带来的误差)。
③洗涤:
该实验中有两次洗涤,请严格按洗涤程序进行。
④显色后先目测,比较样品孔和阳性孔的颜色,若阳性孔的颜色深于样品孔,则样品孔的浓度大于100,样品超标。
⑥加终止液,酶标仪测出吸光度,作为原始记录。
3、玉米赤霉烯酮(ZEN)定性测定法。
注意点:
④稀释:
取滤液1ml,用甲醇水(7:
3)进行稀释,记好稀释倍数;依据国家对小麦、玉米中限量标准来进行适当稀释。
比如:
国家标准最大允许量为60ug/kg,那么滤液应稀释3倍,与浓度为5ng/ml的标准点进行比较。
②试剂的配制:
酶标二抗,洗涤液,DON单克隆抗体。
⑤实验设计:
截取相当数量的反应孔;设定2个对照孔(阴性对照孔(0ng/ml),阳性对照孔(5ng/ml));其余为样品孔(一般一次性测21个样品,以防操作时间过长带来的误差)。
⑥洗涤:
该实验中有两次洗涤,请严格按洗涤程序进行。
④显色后先目测,比较样品孔和阳性孔的颜色,若阳性孔的颜色深于样品孔,则样品孔的浓度大于5,样品超标。
⑤加终止液,酶标仪测出吸光度,作为原始记录。
四、阳性样品的定量检测:
1、黄曲霉毒素B1定量测定法,样品主要为超标样品,通常重新提取样品并制备待测液。
注意点:
①稀释:
取滤液1ml,用甲醇水(1:
1)进行稀释,依据国家对小麦(玉米、花生)中限量标准来进行适当稀释。
比如:
玉米中国家标准最大允许量为20ug/kg,那么滤液本应稀释4倍(允许量除以5)。
但是因超标,所以加大稀释倍数,一般将上述稀释液再进行稀释2~5倍即可。
②试剂的配制:
酶标抗原,洗涤液。
③实验设计:
截取相当数量的反应孔;设定标准曲线孔(0、0.1、0.5、1.0、5.0ng/ml);其余为样品孔。
④酶标仪测出吸光度,作为原始记录。
⑦软件计算。
2、呕吐毒素(DON)定量测定法,样品主要为超标样品,通常重新提取样品并制备待测液。
注意点:
①稀释:
取滤液1ml,用甲醇水(1:
9)进行稀释,依据国家对小麦(玉米、大麦)中限量标准来进行适当稀释。
比如:
国家标准最大允许量为1000ug/kg,那么滤液本应稀释2倍。
但是因超标,所以加大稀释倍数,一般将上述稀释液再进行稀释2~4倍即可。
②试剂的配制:
酶标二抗,洗涤液,DON单克隆抗体。
③实验设计:
截取相当数量的反应孔;设定标准曲线孔(0、10、100、500、1000ng/ml);其余为样品孔。
④酶标仪测出吸光度,作为原始记录。
⑤软件计算。
3、玉米赤霉烯酮(ZEN)定量测定法,样品主要为超标样品,通常重新提取样品并制备待测液。
注意点:
①稀释:
取滤液1ml,用甲醇水(7:
3)进行稀释,依据国家对小麦、玉米中限量标准来进行适当稀释。
比如:
国家标准最大允许量为60ug/kg,那么滤液本应稀释3倍。
但是因超标,所以加大稀释倍数,一般将上述稀释液再进行稀释5倍即可。
②试剂的配制:
酶标二抗,洗涤液,DON单克隆抗体。
③实验设计:
截取相当数量的反应孔;设定标准曲线孔(0、1.0、2.5、5.0、10、50ng/ml);其余为样品孔。
④酶标仪测出吸光度,作为原始记录。
⑤软件计算。
五、实验中注意事项:
1、水:
请用实验室用水(蒸馏水);
2、标准品或提取液使用前:
摇匀;
3、移液器吸头不得重复使用;
4、终止液加入后,轻轻振摇1~2分钟,然后测定吸光度值(因考虑到颜色变化有延迟时间)。
5、试剂保存:
2~8℃冷藏,酶标二抗和单克隆抗体血清管需冷冻储存。
6、大量样品检测时,为避免操作时间过长而引起的误差,请尽量使用排式移液器。
六、软件计算中的问题:
1、软件绘制的曲线评价:
A0.1/A0的值在30%左右,拟合的曲线上对应浓度和标准浓度的相对偏差在5%以内。
2、软件计算中稀释倍数的确定:
滤液的稀释倍数(D);
AFB1含量(µg/kg)=
C×V×D
m
式中:
C------从标准曲线上查得的AFB1的含量(ng/ml)
V------样品提取液体积(ml);
D------样品稀释倍数;
m------样品的质量(g)。
注:
若软件中已经将稀释倍数输入,则最后计算公式中不能将D再代入计算。
七、试剂盒集中采购,价格的优惠政策:
1、根据《全国原粮卫生专项调查任务计划表》来统计相应的试剂盒数量;
2、采购时请一定说明定量或定性检测试剂盒。
3、免费提供相关证书及资质证明。
八、《粮食卫生标准》GB2715-2005
项目
指标(μg/kg)
黄曲霉毒素B1
玉米≤
大米≤
其他≤
20
10
5
脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)
小麦、大麦、玉米及其成品粮≤
1000
玉米赤霉烯酮
小麦、玉米≤
60
赭曲霉毒素A
谷类、豆类≤
5
九、参考资料
1、《原粮卫生检验技术培训教程》
2、《黄曲霉毒素B1酶联免疫测试盒说明书》
3、《呕吐毒素酶联免疫测试盒说明书》
4、《玉米赤霉烯酮酶联免疫测试盒说明书》
5、《粮食卫生标准》
十、联系方式:
0510-85500928(传真),85522291,85514690
编制:
江苏省微生物研究所有限公司
测试盒项目部
2006-04-26
- 配套讲稿:
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- 原粮 霉菌 毒素 检测 手册