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电化学血糖传感器原理与进展
电化学血糖传感器原理及进展
前言
葡萄糖是一种在全世界范围内被分析测试最频繁的物质之一。
电化学法血糖检测系统已经成功开发了3O余年,目前全世界每一年约消耗60亿片电化学血糖测试试纸,是糖尿病人实施血糖自我检测、有效操纵病情的重要手腕。
血糖试纸实质是在一些塑料基片上印刷了导电碳墨和银墨后再复合印刷含酶涂层的生物电化学酶传感器。
我国现有糖尿病人4000万,每一年还以1.5%的速度在增加,对葡萄糖分析检测的研究也曰渐增多,因此,最近几年来有关葡萄糖氧化酶电极的研究论文每一年都有上千篇,国内也有上百家研究单位、lO多家企业在从事血糖仪和血糖试纸的研发和生产。
1 电化学葡萄糖传感器的研究基础
电化学酶法测定葡萄糖可追溯到上世纪的30年代末,那时通过测定铂金电极上过氧化氢的氧化分解而产生的电流转变测算出溶液中因氧的消耗致使的氧分压下降值,进而测得葡萄糖的浓度。
其反映进程如下:
葡萄糖+FAD–葡萄糖氧化酶→葡萄糖酸内酯+FADH2–葡萄糖氧化酶 ①
FADH2–葡萄糖氧化酶+02→FAD–葡萄糖氧化酶+H2O2 ②
H202→2H++O2+2e- ③
25年后,美国的Updike和Hicks成功简化了葡萄糖的电化学测定方式,他们将葡萄糖氧化酶固定在某种胶体基质中实现了酶的固定和稳固化,使葡萄糖氧化酶催化剂能够被反复利用。
尔后他们将固定后的葡萄糖氧化酶制成膜片同Clark极谱式氧电极结合,制成了世界上第一个酶电极。
2 导电介质葡萄糖酶传感器的进展
随着葡萄糖电化学分析系统的成功商业化,1970年Williams等试图采纳分子导电介质取代氧分子进行氧化还原电子传递的尝试。
他们利用铁氰化钾-亚铁氰化钾导电介质系统成功实施了血液葡萄糖的电化学测定,同时还用同一电化学系统测定了血乳酸。
尽管往后这一开辟性的电化学测试原理被普遍利用在公司血糖仪的开发和生产实践中,但遗憾的是那时并未被直接应用于家用血糖仪测试系统的商业化开发。
世界上第一个便携式家用电化学血糖测试系统是1987年由美国Medisense公司推出的ExacTech,该系统采纳二茂铁及其衍生物作为氧化还原导电介质,通过丝网印刷导电碳墨在PVC塑料基片上,制成外观尺寸犹如pH试纸大小的血糖试纸,能够大规模制作生产。
3 血糖测试电化学试纸的产业化开发
由于潜力庞大的全世界糖尿病测试消耗品市场的增加,糖尿病人天天测试血糖的实际需要,实施商品化血糖试纸的开发设计和生产有着极大的商业价值。
任何生产厂家或技术开发商为了提高产品质量,降低生产本钱必将对每一招待开发的测试系统进行全面综合考虑和评估,需要评估考虑的要紧内容包括:
系统的准确度和周密度要求、血糖测定的速度、所利用氧化还原酶的种类和稳固化方式、采样量、进样方式、试纸的外观尺寸,原材料的选择包括导电介质、试纸基片材料和导电油墨,在仪器的外观考虑用户友好界面的设计、利用方便性、元气件器件的价钱本钱、芯片的综合性能因数等。
3.1 现行血糖试纸的整体设计考虑
(1)试纸基片的材料选择
血糖试纸的基片目前都趋向于利用PET聚酯材料,这种材料本身具有必然的折弯机械强度,容易实施机械切割,有利于规模化生产。
材料的耐热温度达到120℃,比较适合导电油墨印刷完以后的高温固化。
为了便于用户利用和操作,基片材料的厚度可操纵在0.35~0.5mm,试纸的实际长宽尺寸一样操纵在6mm×30mm左右。
(2)试纸电极的工作电极和参比电极的油墨
绝大多数血糖试纸的工作电极仍然利用碳墨材料,目前可考虑选择的碳墨有多种,较经常使用的有美国的艾奇森,厄康、杜邦和英国的格温特。
商业化试纸不管利用上述哪一种碳墨均有良好表现。
参比电极传统上利用银/氯化银材料,最近几年来从本钱上考虑也有大量改用碳材料的趋势。
金属材料最近几年来也开始批量利用在血糖试纸的制作中,这种材料包括金、钯、铂金等,通常采纳电化学真空溅射方式均匀涂布在试纸基板表面。
(3)试纸吸血槽的设计
随着对血糖试纸的精度要求不断提高,过去成立在光电比色的基础上实施的滴血加样法慢慢被虹吸式自动进样方式取代。
由于虹吸式自动进样方式具有操纵采样量大小的优势,因此虹吸式吸血槽的设计及其空间大小必需被严格限定而由下例公式计算设定:
t=3μl2/(σcosφ)h ①
式中,t——样品吸入所需时刻;
μ——血液黏度;
l——吸血槽长度;
σ——溶液表面张力;
φ——吸血膜湿润角度;
h——吸血槽高度。
式①说明,试纸端口吸血槽吸血时刻长短同吸血槽长度的平方正相关,同吸血槽的高度和吸血膜的湿润角度呈负相关,因此通过精心设计吸血槽能够操纵和阻碍血糖测试系统的反映时刻和测试精度。
(4)血糖试纸上的试剂配合
血糖试纸作为一种“干试剂”试纸,对试纸上的试剂配合有严格要求。
这种含生物酶的试剂能够混合在印制工作电极的碳墨中直接印刷在塑料片表面,也能够另行配制成水性油墨单独印刷在工作电极碳表面。
利用喷涂设备生产试纸的还应将试剂配成适当浓度的水性溶液涂布在工作电极上。
任何一种试剂配合都少不了以下几个要紧成份:
氧化还原酶如葡萄糖氧化酶、葡萄糖–NAD–脱氢酶、葡萄糖–PQQ–脱氢酶和葡萄糖–FAD–脱氢酶等,各类导电介质如苯醌、铁氰化钾、二茂铁、钌化合物、锇化合物等。
试剂配合中还需要黏合剂,如羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、表面活性剂和酶和导电剂的稳固剂等。
表l列出目前国内外比较经常使用的试纸制作大体原料。
表1血糖试纸制作的大体化学试剂配合
试纸基材
黏合剂
导电剂
试剂酶
表面活性剂
PET
羟乙基纤维素
对苯醌
葡萄糖氧化酶
曲拉通
PP
羧甲基纤维素
铁氰化钾
葡萄糖脱氢酶
土温
PC
胶原蛋白
二茂铁
葡萄糖激酶
道康宁消泡剂
PVC
海藻酸凝胶
金属导电化合物
氟类表面活性剂
3.2 血糖试纸的标定
血糖试纸生产完成后的校准和标定是决定试纸在利用中是不是长期稳固准确的重要步骤。
标定工作包括对每批产品的血糖测定线性范围、批内批间的重复性变异系数(CV),血细胞压积比(HCT)和血液中电化学活性物质对测试系统的干扰等进行分析和评估。
(1)血糖试纸线性测定范围的校准
血糖试纸在出厂前应完成严格的校验程序,这些校验程序不仅决定产品批次的测定有效范围,而且还要设置试纸的校验码(Code)。
通常校验方式需要配制一组6~8个浓度值的血糖样品,该样品能够由静脉血配得(具体方式可参考ISO15193—2003)。
待测的试纸及其血糖仪同标准仪器,别离对这6~8个浓度进行对照测试,取得一组电流数据值进行相关性分析计算,制作出如图10所示的相关性图谱,相关曲线方程中的斜率和截距可用来决定本批试纸的校正码。
一样正常生产的企业每30~50万片一批试纸大约出一个校正码值。
图10 采纳YSI-2300Plus与待定血糖试纸进行对照测定并进行相关分析的图谱
(2)血糖测试系统的周密度和误差同意范围出厂查验中除操纵上述线性范围和设置校验码之外,待定试纸的周密度操纵也十分重要,那个直接关系到出厂试纸的分辨率和重复性等质量品质。
考察试纸的周密度一样采纳CV值来衡量。
实验要求在血糖范围1.1~30mmol/L范围内进行约10个高低不同浓度,总量约300份血糖值的对照测试。
目前商品化的血糖试纸其总的变异系数CV应操纵在5%之内,高于那个CV值那么被判定不合格或直接认定为废品不得出厂销售。
ISO15197-2003标准还对血糖试纸的准确度误差可同意范围做出了限定,一样每批血糖试纸同标准葡萄糖分析仪对照分析测试误差,95%以上需落在±15%范围内,测试数据的100%应落在±20%的范围内。
美国FDA更要求所有血糖测试系统其不同批次的血糖试纸在针对同一血糖浓度进行质控测试时,其变异系数CV必需落在5%之内。
在操纵血糖测试测试系统的准确度方面目前已全面推出利用ClarkeErrorGrid(CEG)方式,也即克拉克网格误差分析法,使得针对血糖测试系统的准确度误差分析更为客观合理和严格。
(3)血细胞压积对血糖测试的阻碍
血细胞压积(HCT)对电化学试纸测定的阻碍已经受到许多大厂家的重视,一样血糖试纸的HCT耐受力在35~55%之问,也确实是在那个范围内血糖测试的结果不受干扰。
可是很多I型糖尿病患者往往HCT高于那个范围,通常会造成血糖测试假性偏低,而很多婴幼儿的HCT又低于那个范围而照成血糖测试值的假性升高。
这两种现象都有可能会误导随后采取的用药方法而造成对病人的损害。
目前国外的大厂家已经开始采取有效的方法在生产的试纸上采取HCT补偿方法,扩大HCT的耐受范围,比如已经有HCT可测试范围在0~70%的血糖试纸问世。
(4)血液电化学干扰物对血糖测试的阻碍
采纳电化学酶电极方式进行血糖测试还要受到血液中电化学干扰物质的阻碍。
美国临床诊断中心标准列出的干扰物质有16种,如表2所示。
任何出厂前的试纸都要实行干扰物的检测以确认出厂产品不受这些干扰物质的阻碍。
表2美国临床诊断中心标准列出的16种电化学干扰物质
干扰物
建议测试水平(mg/dL)
干扰物
建议测试水平(mg/dL)
对乙酰氨基酚
20
抗坏血酸维生素C
3
水扬酸
50
甲糖宁
100
四环素
4
甲磺吖庚脲
1OO
多巴胺
13
胆红素
20
麻黄硷
1O
胆固醇
500
布洛芬
40
肌氨酸酐
30
左旋多巴
5
甘油三酸酯
3000
甲基多巴
2.5
尿酸盐
20
4 血糖测试仪器的开发和生产
国内血糖仪器的开发生产起始于上世纪90年代。
那时的产品外型粗糙、功能单一、生产本钱高、产量低。
随着最近几年来微电子行业的快速进展,单芯片运算机的选择和利用已能完全知足诸如血糖测试和贮存如此的大体功能。
作为一种兼具医疗器械和民用电子产品的血糖测试仪器,除要符合血糖测试的周密度、准确度要求,又要手持轻便、外表美观、多功能、界面友好以适合于不同层次糖尿病人利用,关于血糖测试仪的设计要求是很高的。
血糖测试的原理是依据血糖仪在插入仪器的血糖试纸电极两头施加必然的恒定电压如300mV,当被测血样吸入电极工作区后,试纸电极表面工作区内的葡萄糖氧化酶与血样中的葡萄糖发生氧化还原反映。
通过快速的生化反映(约5s)后,酶电极试纸产生的响应电流在0.1~10μA之间,与被测血样中葡萄糖浓度呈线性关系,在单片机的操纵下检测血样响应电流的大小,从而计算得出准确的血糖浓度值并在仪器液晶屏上显示最终结果。
冻干技术原理与工艺简介
冻干是从冻结的物料产品中去除水分的进程,冻干分为真空冷冻干燥和常压冷冻干燥二种,由于一些条件限制目前采纳的是真空冷冻干燥。
冻干目的是保留产品的完整的生物和化学结构及其活性。
象其它许多的技术步骤,一种冻干的类型被称做升华,是自然发生的。
升华指的是溶剂,比如水,象干冰一样,直接从固态变成气态的进程。
传统的干燥会引发材料皱缩,破坏细胞。
这种情形将可不能发生在冻干里,因为固体组成被在其位置上的坚冰支承着。
在冰升华时,它会留下孔隙在干燥的剩余物质里。
冻干进程分为冷冻、升华、解析干燥三个时期,每一个时期都有相应的要求,不同的物料其要求各不相同,各时期工艺设计及操纵手腕的不同直接关系冻干产品的质量和冻干设备的性能。
一、冷冻时期
冷冻干燥第一要把原料进行冻结,使原料中的水变成冰,为下时期的升华做好预备。
冻结温度的高低及冻结速度是操纵目的,温度要达到物料的冻结点以下,不同的物料其冻接点各不相同。
冻结速度的快慢直接关系到物料中冰晶颗粒的大小,冰晶颗粒的大小对固态物料的结构及升华速度有直接关联。
一样情形下,要求1--3小时完成物料的冻结,进入升华时期。
二、升华时期
升华干燥是冷冻干燥的要紧进程,其目的是将物料中的冰全数汽化移走,整个进程中不许诺冰显现溶化,不然便告冻干失败。
升华的二个大体条件:
一是保证冰不溶化;二是冰周围的水蒸汽必需低于610帕(正确的说法应是低于物料冻结点的饱和蒸汽压)。
升华干燥一方面要不断移走水蒸气,使水蒸汽压低于要求的饱和蒸汽压,另一方面为加速干燥速度,要持续不断地提供维持升华所需的热量,这便需要对水蒸气压和供热温度进行最优化操纵,以保证升华干燥能快速、低能耗完成。
三、解析干燥
物料中所有的冰晶升华干燥后,物料内留下许多空穴,但物料的基质内还留有残余的未冻结水分(它们以结合水和玻璃态形式存在)。
解析干燥确实是要把残余的未冻结水分除去,最终取得干燥物料
生物芯片技术简介
一、 概述:
生物芯片这一名词最先是在80年代初提出的,要紧指分子电子器件。
美国海军实验室研究员Carter 等试图把有机功能分子或生物活性分子进行组装,想构建微功能单元,实现信息的获取、贮存、处置和传输等功能。
用以研制仿生信息处置系统和生物运算机。
产生了"分子电子学"同时取得了一些重要进展:
如分子开关、分子贮存器、分子导线和分子神经元等分子器件,更引发科学界关注的是成立了基于DNA或蛋白质等分子计算的实验室模型。
进入90年代,另一类"生物芯片"引发了人们的关注,通过机械人自动打印或光引导化学合成技术在硅片、玻璃、凝胶或尼龙膜上制造的生物分子微阵列。
实现对化合物、蛋白质、核酸、细胞或其它生物组分准确、快速、大信息量的挑选或检测。
二、分类 依照分子间特异性彼此作用的原理,将生命科学领域中不持续的分析进程集成了芯片表面,构建微流体(Microfluidics)生物化学分析系统。
依照芯片上固定的生物分子的不同,能够将生物芯片划分为:
、DAN芯片、蛋白质芯片及芯片实验室(Lab-on-chip)。
从其功能不同的角度,又可分为:
测序芯片、表达芯片和比较杂交(CGH)芯片。
三、制备1. 材料的要求:
作为必需是固体片状或膜、表面带有活性基因,以便于连接并有效固定各类生物分子。
2. 种类:
玻璃片、PVDF膜、聚丙烯酰氨凝胶、聚苯乙烯微珠、磁性微珠。
3. 芯片制备方式:
①原位合成:
适用于寡核苷酸,通过光引导蚀刻技术。
已有P53、P450,BRCAI/BRCA2等基因突变的基因芯片。
②预合成后点样:
是将提取或合成好的多肽、蛋白、寡核苷酸、cDNA、基因组DAN等通过特定的高速点样机械人直接点在芯片上。
由于该技术相对简易低廉,被国内外普遍利用,目前市场上销售的芯片大多采纳这一技术制作的。
接触式点样:
是指打印针从多孔板掏出样品后直接打印在芯片上。
打印时针头与芯片接触。
优势是探针密度高,通常一平方厘米可打印2500个探针。
缺点是定量准确性及重现性不太好。
非接触式点样:
针头与芯片维持必然距离。
定量准确重现性好,但喷印的斑点大,密度低。
通常1cm2只有400点。
但目前把喷印点直径大小由150~100μm降到30~25μm已成为可能,可将哺乳动物整个基因组DNA点阵于一张芯片上成为可能。
4. 生物样品的制备:
分离纯化、圹增、获取其中的蛋白质或DNA、RNA并用荧光标记,才能与芯片进行反映。
用DNA芯片做表达谱研究时,一般是将样品先抽提mRNA,然后反转录成cDNA。
同时掺入带荧光标记的dCTP或dUTP。
四、检测设备:
以基因芯片为例:
基因芯片的原型是80年代中期提出的,兴起于90年代后期。
基因芯片的测序原理是杂交测序方式,即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方式,能够用图来讲明。
在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。
当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG,与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时,通过确信荧光强度最强的探针位置,取得一组序列完全互补的探针序列。
据此可重组出靶核酸的序列。
杂交反映是荧光标记的样品与芯片上固定的探针间进行特异性选择反映的进程。
芯片杂交属于固一液相杂交。
芯片杂交结果的检测要依据标记的报告分子的种类来选择不同的检测设备。
初期利用的同位素标记法,需通过曝光、显影,再用特殊的扫描仪扫读。
目前最多见最成功的标记法是荧光标记,杂交反映后各个反映点上的荧光位置。
荧光强弱通过芯片扫描仪和相关进行分析,将荧光信号转换成数据。
即可取得有关生物信息。
1. 分析技术:
应用于蛋白质芯片结果的分析,不仅能检测到和芯片上蛋白质发生彼此作用的靶蛋白,而且能同时测算出靶蛋白的分子量乃至结构。
2.CCD检测:
应用于基因芯片和DNA芯片。
分辨率低,一样30~50μm。
3. 激光扫描共聚焦:
应用于基因芯片和DNA芯片。
基因芯片微阵列的点超级微小,利用激光共聚焦原理能够让光路直接聚焦到样品点表面,有效避免杂质信号产生的背景噪音干扰。
包括:
尘埃荧光,样本反面的污染,固相基质如玻璃的荧光信号和来自扫描仪光学组件荧光污染。
共聚焦:
是指光(激发和发射)在两个位置上聚焦。
激发光聚焦在样本上。
发射光聚焦在针孔上。
这一针孔限制仪器在样本表面的聚焦深度从而降低背景信号的强度。
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- 关 键 词:
- 电化学 血糖 传感器 原理 进展