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光场显微镜
LightFieldMicroscopy
光场显微镜
MarcLevoyRenNg AndrewAdams MatthewFooter MarkHorowitz
斯坦福大学计算机科学部
斯坦福大学生物化学部
斯坦福大学电气工程部
图1:
左边是一个通过拍摄通过显微镜的物镜和微透镜阵列的荧光蜡笔蜡斑点捕获的光场。
物镜放大倍率为16倍,1.3mm宽的视场。
图像由1702个子图像构成,每一个微透镜描绘了不同样本的一部分。
每个子图像有202像素,每个代表镜片上不同的点,因此形成了独特的视野方向。
通过提取从每个子图像的一个像素,我们可以制作样本的透视图,即显示在右上角的序列。
另外,通过总结各子图像中的像素,我们可以用浅景深产生正交视图的领域,像一个普通的显微镜,但空间分辨率较低。
在之前剪切光场我们将注重不同的深度,如右下序列所示。
这些图像在计算机实时计算。
摘要
通过将微透镜序列插到传统显微镜中,可以在单一的照片中捕捉生物样本的光场。
虽然衍射的产品在这些光场的空间和角度分辨率的限制,我们仍然可以产生透视视野和栈。
由于显微镜本质上是正交的设备,透视视野代表看待微观样本的一种全新的方式。
从一个单一的照片增加焦点栈的功能使得光敏感的样本被记录。
应用这些重点栈的三维反褶积,我们可以生产出一系列的横截面,可以用量渲染可视化地呈现。
在本文中,我们展示了原型光场显微镜(LFM),分析其光学性能,并展示各种生物样本的透视图,重点栈和重建卷。
我们还展示了通过三维反褶积合成聚焦后相当于直接施加有限角度的断层扫描的4D光场。
关键词:
光场,合成孔径,显微镜,反褶积,断层摄影,体绘制
1. 介绍
在许多生物实验室里,显微镜是主要的科学仪器。
尽管在400年的历史中,其性能和易用性都得到显著改善,显微镜仍有一些局限性。
首先,衍射限制了它们的空间分辨率,特别是在高放大倍率下。
这种限制可以通过增大物镜(数值孔径)的接受角改善,但我们在每一侧光学轴约70度达到实际限制。
其次,在显微镜对象被认为在从一个单一的方向(参见图3)的正投影。
横向的显微镜载物台移动标本,不会产生视差,使其难以消除歧义叠加功能。
第三,显微镜有一个很浅的景深,特别是在高放大倍率和数值孔径下。
在观看厚样本时,此“光学切片”是有用的,但检查整个样本时需要上下移动,这是缓慢的,并且可能不适于活的或光敏感的样本。
第一个限制是固有的物理光,其它是从现有的显微镜出现的。
尽管空间分辨率的成本,可以通过捕捉光场而不是图像移除这些限制。
作为在自由空间中的位置和方向的函数的标量光字段被定义为辐射率。
显微镜的光场问题是Gabor在用两相干光的干扰时第一个发表的。
随后激光的发展使得他的技术实用化,领导了全息摄影和全息显微镜的出现。
不幸的是,全显微照片不仅记录样本还有显微镜的内部,限制了它们的用处。
研究者们也提出的照明或方向的视图,其中的方向被限制在每个图像中的图像捕获序列,但这些方法是缓慢的。
经调查,使用透镜阵列捕捉光场李普曼于1908年发明的整体摄影。
在改进的技术制造微透镜(小于1毫米)的带动下,研究人员提出了利用计算机阵列,3D视频和摄影镜,透镜阵列已被用来建立一个单一的视图点阵列显微镜用超广角的视野,但并不是据我们所知的捕捉到多视点图像。
在本文中,我们将展示通过微透镜阵列放置在中间显微镜图像平面,我们可以在一张照片中捕捉光场的标本。
至于在李普曼的建议,我们牺牲空间分辨率,以获得角分辨率。
然后,我们可以采用光场渲染产生的角度,至少捕捉到我们拍摄的角度限制的射线。
同样,我们也可以使用合成聚焦到一个焦点堆栈,每一集中在不同的平面上的图像的序列。
大多数捕捉光场的设备都是在宏观场景操作(从厘米到米)。
在显微镜下,我们的场景是3-4个大小的数量级。
这种变化范围有几个重要含义:
1. 在宏观场景中,光场捕捉和显示可以使用几何光学来分析。
我们还必须考虑到在显微镜下的波动光学。
正如我们将在第三部分看到的,在产品上的侧向和轴向分辨率中的光场显微镜衍射上限。
2. 在宏观场景中,大多数物体的散射光线使其不透明。
在显微镜下,散射不再占主导,大多数物体会变得部分透明。
这意味着,尽管宏观的场景的三维结构,只能用于基于计算机视觉算法(如形状立体声),但显微镜光场的三维结构可以用于算法重建的预测分析。
在这个类中有两个算法是断层扫描和三维反褶积。
在后者,观察一个焦点堆栈的每一片包含了功能,它的重点是模糊,如果我们知道这个模糊的性质,我们可以运用逆滤波将其移除。
虽然对声音敏感,三维反褶积通过用普通显微镜的图像呈现,这使其成为激光共聚焦显微镜的廉价替代品。
在本文,我们将展示人工合成光场的焦点栈也可以反褶积,如在第4部分。
得到的切片数目因为光场的轴向分辨率而有限,但卷可以从一张单一的照片产生。
再者,由于显微镜光场是在一个范围内的视场角的一组突起,有限的角度的断层扫描可以被直接应用到光场,产生一个卷。
正如在附录A,三维反褶积和有限角度的断层扫描-在不同技术领域的发展-实际上是一样的东西。
2. 光场显微镜(LFM)
如果将一个传感器放置在小透镜后面,并没有远心停止(如图3(b)),每个小透镜阵列上的从该位置观察到的场景的立体图记录。
解释为两个平面的光场,它的角,或紫外线,分辨率取决于透镜片数,其空间或ST,分辨率取决于每个小透镜后面的像素数。
将透镜放在物体侧上的小透镜阵列,和定位这个镜头让现场集中在阵列上,调换光场。
现在其空间分辨率取决于小透镜的数目和其每个小透镜后面的像素的数目的角分辨率。
首先的优势是机身薄。
然而,人类对低空间分辨率的低角度的分辨率比更宽容,它很方便地构建比数以千计的小透镜的高品质的高品质的一个场透镜系统的厚度,因此,如果是不是一个问题,后者的安排是优选的。
对于一个显微镜,其中的图像的分辨率是至关重要的,场透镜是必不可少的。
这种选择也允许我们重用的最关键和高度优化的组件在一个常规的显微镜,(参见图2(a))。
显微镜物镜是一个高度校正的光学子系统能够捕捉撞击,在高达71度的角度从光轴(在空气中)的射线。
这将是具有挑战性的,以取代该子系统具有微透镜阵列,实现令人满意的光学性能。
因此,我们决定离开目标单独放置在中间像平面中的微透阵列,如在图2(b)所示。
图2(c)显示了我们的原型光场显微镜。
我们的规格制造的微透镜阵列自适应光学,模塑环氧树脂中,并安装在一个光学质量的玻璃窗口。
在平面图中,微透镜是平凸和方形的。
序列的大小,微透镜曲率和微透镜尺寸将在第三部分讨论。
显微镜通常采用一个冷却像素的摄像头的收集更多的光线,尤其在荧光研究中,但我们不是光饥饿在我们的概念验证实验,与这些相机相比,我们需要更高的分辨率,所以我们采用了1280万像素的数码单反相机,并在必要时使用长时间曝光。
图1展示了由后我们的原型的颜色去马赛克,旋转轴对准的微透镜的子图像记录的示例性光场,缩放以使它们组成一侧的像素数目。
每个子图像记录L(?
?
S,T)和内子图像的每个像素记录?
(U,V,?
?
)。
我们采用了实时合成孔径聚焦程序计算焦点栈。
图1和图3显示了示例图像,后图说明了斜视角c比集中视角d声音大。
这是因为前者只使用从每个微透镜的一个像素,而后者使用所有这些。
对于普通的显微镜,他们牺牲了空间分辨率,但并不牺牲聚光能力。
在第5部分我们会会到这点。
显微镜的光学系统不同于相机,这使我们的光场显微镜有几个方面不同于光场相机。
其中的两处不同尤其值得讨论:
图2:
我们的光场显微镜的设计。
(a)在透射式光学显微镜中,光源通过A处的聚光镜汇聚到B上的样本上。
C处的物镜把样品放大,在中间图像平面D上生成一个真实的图像。
在以前的显微镜中,这个平面位于显微镜的管道内。
E处的目镜进一步放大图像的中间部分,当把目镜E调到无限远档时产生第二个图像。
(b)在我们的设计中,目镜是可以移动的,在中间图像平面放置一个微透镜阵列F,同时在其后面G的位置放置一个摄像传感器,这样放置可以使每个透镜都能看到物镜的清晰的图像。
从光场角度来说,如果物镜孔径和样品构成uv和st两个平面,摄像传感器和微透镜阵列可以对这两个平面重新成像。
这幅图不是按比例画的,距离显示在它后面。
(b)我们的原型包括一个尼康显微镜和一个定制的微透镜阵列(红圈中)。
为了避免做成一个特殊的相机,我们用佳能单反的1:
135毫米微距镜头重新设计了G。
显微镜是正投影。
在常规摄像镜头中,透镜的各个部分都参与生成现场图像的每个点(图3(a))。
与此相反,显微镜的物镜包含一个阻止焦距的东西(一个物理环),这个环在透镜的后面(图3(b))。
这使得它们的物镜空间呈远心的[金斯莱克,1983,88页],意思是:
1.显微镜产生正交视图,不能透视,2.解释在x或y的阶段不提供视差,3.当它们成为焦点时,特征不改变位置,4.其孔径的镜头的直径没有给出,但其孔径(图3(b)中的锥的基础上)和视场(2倍两圆锥之间的距离)的总和,和5.散焦模糊(图2(a)中的双锥形ABC),这成为解卷积的点扩散函数(PSF),它相对于x和y位移不变。
第一个和第四个属性意味着,如果我们要得出正确的观点,就必须把这个远心放在我们的光场渲染软件中。
幸运的是,这是简单的。
st平面被设为视场,uv平面被设置为图3(b)的基准中的锥,但w平面(齐次坐标的平面顶点)等于零(请参阅[左旋?
1996年])。
这会把uv平面放在无穷远,这会导致输入的数据被视为正交。
第二个和第三个的属性意味着显微镜缺乏基于视差的深度线索。
因此,当显微镜学家们看到我们的透视图和虚拟视点转移能力时会非常兴奋。
第五个属性对于三维反卷积显微技术的功能是必不可少的,这将在第4节讨论。
照度必须在空间上和角度上均匀一致。
当记录在透射光下的半透明样品的的光场时,任何空间或角度照明的不均匀性将出现在光场中,无论是分别作为对周边捕获图像的衰减程度还是每个微透镜的子图像,[皮勒1977]。
鉴于存在空间非均匀的光源,如白炽灯或弧光灯,它可能是通过调整显微镜台下聚光器的高度来强制光在空间上均匀的(所谓的柯勒照明)或角度均匀的照在试样上,但不能同时均匀的。
在我们的样机中,我们使用扩散器来近似达到理想条件,但是,这产生了一些不必要的杂散光,如果加个光纤加扰器效果会更好。
记录光场中的大多数荧光样品时,角分布的荧光对于角分布的激光复试来说是独立的,这些仅仅需要空间的统一。
许多研究级荧光光源都满足这一条件。
图2:
显微镜光场的几何形状。
(a)在一个不受限制的光学系统中,A面过来的的光线投射过B镜,逆变换到中间像平面(关闭页)C,在一个理想的透镜,这些圆锥(红色线)的重心点(红点)的第一主点,这是有效的镜头视角的中心。
(b)在显微镜的物镜中,一个阻止面D被放置在透镜焦距的后面(距第二投影中心一个焦距的位置)。
这些所谓的组织模块可以过滤周围的某些特定光,从而导致锥体成为对称的,并具有恒定的宽度。
这些被改变的圆锥体的质心是垂直和平行的,同时生成一个正投影视图。
(c)胚胎小鼠肺,通过从每个微透镜的图像中提取一个偏离中心的像素计算得出的斜视正投影视图。
为我们的互动观众所附的图解除了物镜(顶部的灰色部分)外都是按比例绘制的。
物镜是16×/0.4NA(干),这可以是视野偏离垂直线15度,当前视野(并联的灰色线)距离垂直线一半左右。
另外,可能会产生透视图。
(d)综合焦点视图,由高于原始焦点平面(水平灰线)100微米的平面(水平绿线)汇聚光线而成。
使焦点平面倾斜是可能的,甚至可以使焦点平面弯曲。
3.设计优选和光学性能 不像光场相机的设计可以由射线图计算出,光场显微镜的行为主要受到光的波动性的控制。
傅立叶光学的主要成果之一是,光从物镜出来穿过透镜传播是限带的NA/λ,其中λ表示光的波长,NA,或者叫做数值孔径,等于nsin(θ),其中θ是透镜的边缘(边缘光线)相对于射线(参见图3(b))的角度,n是与透镜相邻的介质的折射率。
因此,在图像中的信息(或在的镜头光圈的任何平面上方)是限带的,这可以由具有λ/(2NA)采样区间的原始对象的奈奎斯特采样版本来代表这些信息。
图像中的有限信息意味着单样本(在这些平面上)与它们没有方向上的关联性。
每个都发射球面波,其具有强度和相位,但没有方向信息。
方向信息来自一起聚合的样本数——样本数目越大,可区分射线方向的数目越多。
这种空间定向的分辨率是一对一的,所以它们发出的光是固定的。
在传统显微镜中,我们只使用空间信息,所以,使图像中的解析点的数目与被定义的样本中的数目是相同的。
如果我们把在影象平面上放置一个微透镜阵列,我们可以保存一些定向信息,但仅提供通过每个微透镜捕获的样本数,会降低图像的空间分辨率。
三个主要参数控制光场显微镜的设计:
微透镜阵列和曲率的大小,各个微透镜的大小。
记住前面的讨论,前两个参数应该这样选择,以使传感器的分辨率和光场中的信息被最佳使用,第三个参数可以自由选择,它可以让我们权衡显微镜的横向和轴向分辨率。
微透镜阵列的大小。
由于我们把微透镜阵列放在中间图像平面上,所以其大小应大于物镜在那里生成的图像的大小。
这等于样本的线性视野范围乘以物镜的横向放大率M(图2(a)中两条红线的比率)。
对于典型的物镜,M的范围从10x~100x,中间图像是直径为50mm~60mm的圆。
这只是最里面的19mm~23mm的校正像差。
目镜会从中间图像中剪掉较小的直径,并将其称为在显微镜的视场数。
由于我们的空间分辨率受微透镜中心距离(比较大)的限制,目镜中的小的像差不会像在高分辨率的系统中那样严重的影响到我们。
因此我们觉得这样设置我们光场显微镜中的数据是合理的:
我们样机中的微透镜阵列的尺寸是36mm×24mm,并非刚好是一个35mm全帧摄像传感器的大小。
透镜曲率:
一个多透镜光学系统的分辨能力取决于它众多透镜中NA值最小的那一个透镜。
为了确保微透镜不会限制我们的光场显微镜的分辨率,同时也为了确保物镜的图像准确的填充传感器平面而不会有重叠或者是留有缝隙,这些微透镜的数值孔径应该与物镜图像的数值孔径相匹配,后者的计算方法是NA除以放大倍数M,公式如下:
例如,对一个40X/0.95NA的物镜,在空气中最大的NA,我们应该使用f/20的微透镜阵列
在我们的标准中,微透镜阵列是125u,,所以他们的焦距是(125u)*f/20=2.5mm.这在图2(b)中正是从F到G的距离。
微透镜允许使用者通过旋转机械装置在几个物镜中选取一个。
在未来的微透镜中,你可能想象出拥有第二个转念动装置,它里面是微透镜阵列。
幸运的是,一个物镜的NA是随着他的放大倍数而提升的,这一性质具有保持图像数值孔径为常数的作用。
因此,有可能找到具有不同放大倍数的物镜但是使用相同的F-数值的微透镜。
为了证明这一点,图像4展示了出射光瞳的大小以及微透镜的F-数值怎样随着物镜的放大倍数和数值孔径而变化。
请注意,那些间断的水平线表明我们的f/20阵列与很多比较常用的物镜相交,包括20X/0.5,40X/0.95,和60X/1.4.
从这份图我们可以得到的另一个观察结果是,为了适应低放大倍数、高NA的物镜,我们必须使用更强大的显微镜。
这样的结合允许我们得到更清晰的图像,或者更大的角度视差,假设我们使用合适的显微镜阵列和传感器。
然而,构建这样的系统将会是充满挑战的,因为这样的系统需要更大的出射光瞳,因此就需要各大体积的物镜。
最终,我们扩大螺纹桶的直径,物镜正是通过这个螺纹桶被拧进转动机械装置的,就如同图中上面的段冲水平线所显示的那样。
为了利用线的上方所展示的这种结合,我们必须设计新的显微镜。
透镜尺寸和横向分辨率:
在利用小透镜阵列和场透镜的立体照相中,我们分别通过选择小透镜的数量Ns×Nt和每个小透镜像素的数量Nu×Nv控制空间和角分辨率。
如前所述,显微镜的总体分辨率Nu×Nv×Ns×Nt是受到可分解的样品中样本点数的限制的。
对这个分辨率一个常用的衡量是麻雀限制,它被定义为标本的两点之间的最小间距,这样强度沿着一条
连接他们的图像中心的线就显示了一个可测量的倾角。
麻雀限制几乎和前面讨论的奈奎斯特标准样品间距一样。
表示为在中间图像平面的距离,其计算公式为:
公式中λ是光波的波长。
因为微透镜阵列不改变可分解的斑点的数量,我们唯一的选择是需要多少角分辨率,或者多少空间分辨率可以被牺牲掉。
它们之间的关系式是
式子中的W×H是透镜尺寸,Nu×Nv是每个透镜背后的可分解的斑点的数量。
例如,在绿光中(535nm),一个40×/0.95的物镜,它的Robj是10.59u。
使用我们的36×24毫米量级的传感器,我们可以获得上限为3400×2266可分解的斑点。
在选择125μ的微透镜的前提下,我们能够获得288×192像素的图片,在目标空间下我们的像素大小是125μ/40×=3.1μ,我们应该期待Nu=Nv=125μ/10.59μ=11.8的可分解的斑点。
3.1μ是我们标本的横向分辨率,11.8点是我们的角分辨率。
角分辨率在轴向分辨率的影响将在下一章节被论及。
轴向分辨率:
在横向分辨率之后,显微镜专家最担心的是轴向分辨率——通过重新聚焦区分不同深度的显微镜的能力。
通常公认对轴向分辨率的衡量是景深。
在摄影中、景深公式可以单独由几何光学导出在显微镜下波动光学增加了一个新的术语,来解释这个事实,当光非常集中,它仍有空间范围。
这两个术语的总和给出了总的景深。
在这个公式中e是图像中采样点的间距。
在我们的显微镜中有三种情况需要考虑:
(1)只有显微镜:
在一个普通的显微镜中有一个照相机在图像平面中间,e是传感器的像素间距。
如果我们假设这些都足够小,不限制分辨率,我们得到一个表达式,用波术语表示为:
(2)有微透镜:
在这种情况下有效像素Nu×Nv倍有限的衍射光斑尺寸的,因为我们是成像每个透镜背后的许多斑点。
让我们假设Nu=Nv,这将得出一个表达式,用几何术语表示为:
(3)单透镜像素:
如果我们看看透镜背后的像素,使用波术语的表达式仍然是相同的,因为光学系统的NA是没有改变,但是在几何术语的表达式中增加了限制组射线,而这些射线形成每个像素
可用的角度信息。
正如同在[Ng2005]中证明的那样,这通过Nu因子增加景深。
在我们这种情况下,可以的出公式:
为了证明这些公式,在表1中给出了三个物镜的景深。
在我们是应用中,Dtot3是从实际可操作的观点的的到的景深,Dtot2是从聚焦综合的角度得到的景深,Nu是切片的数量,这些切片具有不重叠景深。
尽管在这个表第三列安排用于捕获图1,但是在我们的佳能5D中像素间距低于所需的分辨率,就如同前面所提到的那样。
这一不足将Nu在图中的值限制在了大约7个可分解的斑点,同时将可观察到的景深限制在了大约表中所示数值的一半。
Table1
图5显示了两个实验的结果旨在确认我们的模型的有效性。
在这些实验中我们使用5:
1的微距镜头来规避我们相机的有限的分辨率。
在图5(a),我们测量能得到的每个透镜的图像的分辨率。
当我们的光场显微镜是故意散焦时,每个透镜形成一个一小部分标本的透视图;散焦越大,包含的标本部分就越宽。
图5
图6 用反卷积显微镜对一个荧光珠的3D重建(a)沾上BODIPY(InvitrogenFocalCheckmicrospheres#F-7235), 放在浸油中,用40倍/1.3油的尼康福陆物镜(由于中间的管状镜头,操作时用49倍),其落射照明在480nm,受激发射在535nm。
(b)理论上对这个目标的PSF,加强后来演示。
(c)一个(灰度)焦点堆积的垂直截面,通过移动这个阶段,40微米有1微米的增量来获得的。
焦点堆积代表通过PSF得到的物质珠真实的卷积。
(d)去卷积量的截面,注意深色的中心,相对于(c)没那么模糊。
萝卜状的顶部和底部从在目标上获取的一组有限的光线上产生。
(e)同样的珠的光场,用同样的物镜和显微镜头阵列来拍摄。
每一个显微镜头可以在物体上覆盖3*3微米,所以小珠只包含5*5的镜头。
(f)(g)是合成物的聚焦过程的PSF。
(g)是从凭经验测量的“核心”中计算出来的。
(f)是文本中的理论描述。
(h)是焦点堆积的横截面。
(i)是去卷积量的截面。
定性地,这个结果比(d)更加有利,虽然分辨率比较低。
这些重建每一个需要在电脑上花费几分钟来计算。
用这个举动,我们可以降低这个阶段并且成像出收缩光栅的图像,然而,在这个比例上,这样的图像是不可得的。
于是,我们采用一个网格,然后移动显微镜头通过一系列的Z位置。
当网格线变得难以区分的时候,我们用已知的成像微透镜的几何估计的图像分辨率,在等式
(2)中,这个分辨率代表Robj经验测量值。
(我们说大约是因为在最佳焦点平面附近的的景深是不对称的)。
虽然我们能够在测量误差范围内确认这些值,图5(b)中合成的图像比我们想的要软一些,可能是由于未矫正目标中的球面像差。
4.3D重建
计算机视觉中从物体的图像中去估计它的三维形状是一个核心的问题。
两种普遍的方法是,立体形状,它使用从不同位置的观察点获得的两个或者更多的视角。
还有焦点成形,它从同一个位置去获得两个或者更多的视角,只是焦点设置不同。
由于照相机的光圈可以被理解为一个间隔紧密的观察位置的集合,这两种方法之间存在密切的关系[Schechner2000a]。
计算机视觉也可以应用到微观标本如果他们有粗糙,几乎不透明的表面。
其中一个例子是形状对焦方法[Nayar1990;Shah1992],它可以被扩展通过增加结构照明来处理光滑的表面[Noguchi1994]。
对于半透明的物体,基于小数量的不同焦点视图的方法不再可行。
相反,必须将每个视图通过物体投射。
如果孔径是针孔,目标函数的值(无论其是线性衰减或是发射)被整合沿着射线穿过针孔。
如果针孔被替换为一个理想的透镜,然后积分与积分双圆锥体沿射线被替换集中在点的对象是焦点[Swedlow1997]。
这双锥体是点扩散函数(PSF)的镜头,它所代表的是由于散焦造成的模糊。
如果包括衍射效应,则PSF变成沙漏形,在焦点平面有一个有限的腰部。
沿其光轴移动透镜轴,我们集中在不同的深度形成一个图像序列即一个焦点堆栈。
这个过程是一个由PSF的对象形成一个三维的图像的卷积。
通过3D去卷积运算得到的重建试图去重新分配记录在每个像素的光,那是由于模糊回到他们所来自的体元。
就是说,它试图估计提供的对象的3D图像和PSF。
虽然模糊卷积可以表示为一个矩阵乘法和直接倒[Castleman1979,p.354],该矩阵通常对这种方法情况是很糟的。
相反,可以使用迭代算法。
为了确保收敛得到一个有意义的结果,使用一些约束条件,例如,应用对象必须每处都是正的(见附录A),在本文中,我们采用该算法的一个实现,其中第一个为对象的猜测从维纳滤波的三维图像中形成,并且PSF是经验提供的。
[Holmes1995]。
图7:
在透射光下拍摄的蚕口的三维重建。
我们的目标是40×/1.3尼康氟油浸物镜(由于冷凝器工作在1.25NA)。
通过我们的微透镜阵列获得一个照片,综合集中创建一个80微米1微米间距的堆栈,去卷积如文中所述。
(a)从焦点堆栈的切片。
(b)去卷积量后的切片。
(c)-(e)从不同视角的最大投影量的效果图。
为了得到更清晰的效果图,所有图像都显示在倒灰阶。
显微镜的PSFs的经验测量通常是记录一个在荧光珠的焦点堆栈的次解析度。
这个焦点堆栈显示了两种衍射的影响和散焦。
在我们的例子中聚焦是进行合成的,所以,必须使用不同的程序。
我们首先使用标准协议来记录一个0.2μ小珠的光场。
由于我们的微透镜是大于衍射极限,在珠子填充只有一个微透镜的子图像,在图6的(f)所示。
然后,我们执行合成光场聚焦在此,在图6(克)制备的PSF。
由于聚焦系统是合成的,此PSF是没有噪声和畸变的,,但它正确地反映所捕获目标的角度范围内的光线,包括任何的强度衰减。
图6中的其他比起15微米的荧光珠的3D重建——一个标准的测试物体——基于焦点堆积的显微镜载物台重新定位(上排),或通过捕捉和综合聚焦光场(下排)。
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