第六章单倍体的产生.docx
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第六章单倍体的产生
第六章单倍体的产生
1引言
1.1单倍体的概念
所谓单倍体,指的是具有配子染色体数的个体或细胞。
一倍体:
只含有一个染色体组的个体或细胞(n=x),一倍体不能进行减数分裂,所以是不育的。
二倍体:
含有二个染色体组的个体或细胞(2n=2x,n代表配子染色体数,2n代表合子染色体数,x代表染色体组)。
三倍体:
具有三个染色体组的细胞或个体。
四倍体:
具有四个染色体组的细胞或个体。
多倍体:
细胞或个体中的染色体组数多于二个。
整倍体:
体细胞内含有完整的染色体组的类型称为整倍体。
非整倍体:
如果在二倍体的基础上,增加或减少个别染色体,这种变异的细胞或个体叫非整倍体。
1.2单倍体在遗传研究和植物育种中的意义
(1)在单倍体细胞中染色体组减半,表现型和基因型一致,一旦发生突变,无论是显性还是隐性,在当代就可表现出来。
单倍体植株中由隐性基因控制的性状,虽经染色体加倍,但由于没有显性基因的掩盖而容易显现。
因此单倍体是体细胞遗传研究和突变育种的理想材料。
在诱导频率较高时,单倍体能在植株上较充分地显现重组的配子类型,可提供新的遗传资源和选择材料。
(2)在品种间杂交育种程序中,通过F1代花药培养得到单倍体植株后,经染色体加倍立即成为纯合体,从杂交到获得不分离的杂种后代单株只需要2个世代,和常规育种方法相比,显著缩短了育种年限。
1.3获得单倍体植株的途径
单倍体的重要意义虽然早已为人所知,然而,由于在自然界单倍体出现的频率极低,只有O.001%~0.01%,因此以前它们并未得到广泛的利用。
目前,人们诱导单倍体植株主要采用整体操作技术和花药、花粉的离体培养技术。
1.3.1整体操作技术
①雌核发育。
通过阻止授粉途径(利用预先离子辐射处理的花粉或使用不亲和花粉),引起未受精卵细胞发育成单倍体植株。
②胚珠雄核发育。
由有雄核的卵细胞发育成单倍体植株。
在这种发育途径中,卵细胞核在受精前发生消失或失活。
③通过远缘杂交消除一个亲本的基因组。
这种情况出现在属间和种间杂交中,在受精之后的发育过程中双亲之一的基因组被选择性消除。
于是,形成的胚只具有一亲本的基因组,由此发育形成的植株理所当然属于单倍体。
④半受精。
杂交过程中,卵细胞核与萌发花粉粒产生的精核不发生融合,各自独立地进行分裂,产生嵌合的单倍体植株。
⑤化学处理。
一些化学试剂如氯霉素和对氟苯丙氨酸,可能诱导体细胞或组织中的染色体丢失,产生单倍体。
用甲苯蓝、顺丁烯二酰肼、一氧化二氮和秋水仙素也可能产生类似的结果。
⑥高低温处理。
高低温处理,可以起到抑制配子融合,诱导单倍体的作用。
⑦辐射效应。
据报道,X射线或紫外线能诱导染色体断裂,导致亲本的染色体丢失,形成单倍体植株。
1.3.2花药、花粉的离体培养技术
整体处理方法获得单倍体植株的频率低。
与此相反,使用离体培养的方法成功获得的单倍体植株数量惊人。
通过花药培养(花药孤雄发育)或花粉培养诱导获得的单倍体涉及34个科约247种植物,其中包括不少有重要经济价值的植物。
茄科植物特别容易诱导产生单倍体,然而十字花科、禾本科、毛茛科等植物通过花药孤雄发育(此后称为雄核发育)、单个花粉粒培养也能诱导获得单倍体。
目前,这项技术已成为人们获得单倍体植株的主要途径。
2通过花药和花粉培养产生单倍体的理论解释
花药和花粉培养都指在合成培养基上,改变花粉的发育途径,使其不形成配子,而像体细胞一样进行分裂、分化,最终发育成完整植株。
只不过后者是将花粉从花药中游离出来,成为分散或游离态进行培养。
从组织器官角度来说,花药培养属于器官培养的范畴,而花粉培养属于细胞培养的范畴。
但两者的目的都一样,就是要诱导花粉细胞发育成单倍体植株。
花药(anther)是植物花的雄性器官,包括二倍性的药壁和药隔组织以及单倍性的雄性性细胞—花粉粒(pollengrain)。
一个花药的每个花粉囊中都充满了花粉粒,每个花粉粒在母体植株上的最终角色都是发育成一个雄配子体。
但在花药的离体培养过程中,花粉粒的命运会脱离常轨,最终发育成一个单倍体的孢子体。
为什么会这样呢?
这涉及到花粉小孢子的发育途径。
2.1活体小孢子发育途径
一个花粉母细胞经过连续2次细胞分离(第一次减数分裂,第二次有丝分裂),形成4个子细胞,称为四分体,四分体分散成单核花粉粒。
在正常情况下,单核经第一次有丝分裂,产生一个大而疏松的营养核和一个小而致密的生殖核,称二核花粉粒。
第二次有丝分裂仅限于生殖核,形成两个精子,它们处在花粉或花粉管中,称为三核花粉粒。
最后花粉粒进一步膨大,花粉进入成熟期。
2.2离体小孢子发育途径
在离体培养条件下,花粉是产生花粉植株的原始细胞,我们把花粉形成植株的途径称为“花粉孢子体发育途径”。
目前,多数学者习惯把小孢子或花粉沿孢子体途径发育成花粉植株的过程称为“雄核发育”。
离体培养时,小孢子在培养过程中呈现不同的发育模式。
目前,一般根据小孢子第一次有丝分裂的情况将雄核发育分为A途径(不均等分裂)和B途径(均等分裂),其中A途径又根据第二次分裂及其以后的情况细分为A-V途径、A-G途径、A-VG途径(又称E途径)及C途径(图6-1)。
图5—1小孢子正常发育途径与离体培养条件下胚胎发育途径比较
A.第一次有丝分裂为非均等分裂,形成一个营养核、一个生殖核
A-V.营养核重复分裂而生殖核败育
A-G.生殖核重复分裂而营养核败育
A-VG.生殖核和营养核共同分裂
C.营养核、生殖核分别或同时进行核内复制,有丝分裂后核融合分别形成二倍体、三倍体、四倍体胚
B.第一次有丝分裂为均等分裂,形成两个相似的营养型核,进而重复分裂形成单倍体胚或先核融合然后重复分裂形成多倍体胚
D.自然条件下小孢子的第二次分裂、淀粉粒及萌发形成的花粉管
2.2.1A途径小孢子的第一次有丝分裂按配子体方式进行,为不均等分裂,形成营养细胞和生殖细胞(或营养核和生殖核),这种途径又可细分为以下几种途径:
(1)A-V途径多细胞花粉(或多核花粉)由营养细胞重复分裂衍生而成,生殖细胞以游离核的形式存在一个周期后退化,或分裂一至数次存在于多核花粉的一侧,有的甚至到球形胚形成仍存在。
因此,生殖核并不参与花粉孢子体的形成,在花粉中往往可以观察到生殖细胞的存在。
(2)A-G途径生殖细胞进行多次分裂形成胚状体,营养细胞不分裂或者仅分裂数次形成胚柄结构。
由生殖细胞形成的细胞群其核致密,染色后着色较深,容易同营养细胞衍生而来的细胞群区分开来。
(3)A-VG途径(又称E途径)花粉内的营养细胞和生殖细胞独立分裂,形成两类细胞群,各群的子细胞都类似其母细胞。
(4)C途径在获得的花粉植株群体中,除单倍体外,常有相当比例的二倍体、三倍体、四倍体、非整倍体等非单倍体植株,即出现小孢子培养过程中染色体自发加倍现象。
1977年,Sunderland提出C途径,即生殖细胞和营养细胞通过核融合后共同形成多细胞花粉,产生非单倍体植株。
此途径中生殖核与营养核共同参与了花粉植株的形成。
2.2.2B途径小孢子第一次有丝分裂为均等分裂,形成两个大小相近的细胞(或游离核)。
以后,由这两个细胞(或游离核)连续分裂产生单一类细胞组成的多细胞花粉或多核花粉。
2.2花粉植株形态发生方式
如果不考虑小孢子核的早期分裂行为,花粉植株的形态发生有两种途径,即胚状体发育途径(直接发生途径)和愈伤组织发生途径(间接发生途径)(图6-2)。
图6-2花药培养与花粉植株的形态发生方式
3花药培养的一般程序
3.1取材
花药在接种以前,应预先用醋酸洋红压片法进行镜检,以确定花粉的发育时期,并找出花粉发育时期与花蕾或幼穗的大小、颜色等外部特征之间的对应关系。
一般而言,单核后期花药对培养反应较好。
但值得注意的是,这种相关性绝不是一成不变的,而会因品种和气候的不同而异,因此,在实验中还必须由每个花蕾取出一个花药,通过镜检确定花粉发育的准确时期。
3.2预处理
适当的预处理可以显著提高花药的愈伤组织诱导率。
常用的预处理方法是低温冷藏,具体的处理温度和时间长度因物种而异:
但低温预处理对小麦效果不稳定,有时还有负效果。
3.3消毒
花药适宜培养时,花蕾尚未开放,花药在花被或颖片的严密包被之中,本身处于无菌状态。
因此,通常只要以70%酒精喷洒或擦拭花器或包被着麦穗的叶鞘表面,即可达到灭菌要求。
3.4接种
在无菌条件下把雄蕊上的花药轻轻地从花丝上摘下,水平地放在培养基上进行培养,在整个操作过程中不应使花药受到损伤,若受损伤,则应淘汰,因为损伤常常会刺激花药壁形成二倍体愈伤组织。
如果所碰到的是花器很小的植物,如天门冬属、芸苔属和三叶草属植物等,可能需要借助解剖镜夹取花药,或是只把花被去掉,把花蕾的其余部分连同其中原封未动的雄蕊一起接种在培养基上。
在有些情况下,甚至是接种整个花序以得到花粉单倍体。
然而这种简单化的方法只适用于这样一些基因型,即其中雄核发育在只含无机盐、维生素和糖的简单培养基上即可进行,而在这种培养基上孢子体组织增殖的机会很少。
不过,当必须使用生长素才能诱导花粉粒雄核发育的时候,应当尽可能把孢子体组织去掉。
由于花药对离体培养的反应存在“密度效应”,因此每个容器中接种的花药数量不宜太少,以形成一个合理的群体密度。
3.5培养方式和培养条件
培养方式:
花药的培养方式主要有3种:
一是在琼脂固化培养基表面培养,二是在加入30%Ficoll(水溶性聚蔗糖)的液体培养基表面飘浮培养,三是利用固体一液体双层培养基培养,以便既能保持较高的接种密度,培养基又不易失水干涸。
培养条件:
主要包括温度和光照。
(1)温度花药对培养温度的要求因物种而不同,对于大多数小麦品种来说,在培养的最初6d给以30~32℃的较高温度,然后再转入28~30℃下培养,花药出愈率会有明显提高。
水稻花药培养的适宜温度从一开始就是27℃。
愈伤组织分化阶段对温度的要求不像诱导阶段那样严格,例如小麦在17℃和30℃下花粉愈伤组织分化频率没有显著差异,水稻花粉植株的分化也多在和诱导期间相同的温度下进行。
(2)光照对光照的要求在物种间差异更为明显。
如连续光照可显著增加烟草花粉胚的产量,却强烈抑制曼陀罗的花粉胚胎发生。
禾谷类植物在花粉愈伤组织诱导期间则以暗培养或散射光培养效果较好,强光会抑制小麦花粉愈伤组织的形成。
愈伤组织的分化原则上都应在光照下进行,但对光照强度和照光时间的要求则因物种而异。
例如水稻花粉愈伤组织在转入分化培养基之初仍不宜照光培养,须待3~5d后再给以每天14h,1000~2000lx的光照,以免引起愈伤组织的老化坏死。
对小麦花粉植株则不宜给以长日照。
3.6花粉植株的诱导
烟草花药接种在无激素培养基上1周以后,即有部分花粉粒开始膨大,2周以后细胞开始不断分裂,相继形成球形胚、心形胚和鱼雷形胚等,3周后在花药开裂处即可见到许多淡黄色的胚状体,见光后变绿,并逐渐长成小苗。
禾本科植物的花药在培养中通常不能形成胚状体,在这类植物中,花粉植株的诱导往往要分两步进行。
第一步,将花药接种在含有2,4-D(1~2mg/L)的诱导培养基上,诱导花粉粒形成单倍体愈伤组织。
第二步,当花粉愈伤组织形成后10~15d,其直径已长到1.5~2.Omm时,及时把它们转到分化培养基上诱导植株分化。
分化培养基中不含2,4-D,含有NAA和KT各0.5mg/L。
在分化培养基上,愈伤组织表面陆续分化出芽和根。
在烟草中,花粉植株是经由胚状体产生的,因此几乎都是单倍体。
在稻麦等植物中,由于花粉植株是经由愈伤组织产生的,染色体数常有变化,其中既有单倍体,也有二倍体、三倍体以及各种非整倍体等。
4花粉培养
在花药培养中,由于一个花药内的花粉粒在遗传上是异质的,因此,由一个花药所产生的植株,将构成一个异质的群体。
如果单倍体植株是经由花粉愈伤组织的途径产生的,由于从若干花粉起源的愈伤组织常常混在一起,因此由一个花药形成的愈伤组织将会是一个嵌合体。
而且,如果在花粉愈伤组织化的同时,花药壁细胞也进行增殖,那么最终所得到的愈伤组织就不可能具有纯粹的配子体起源。
解决这个问题的方法是培养离体小孢子或花粉粒,并诱导它们进行雄核发育。
与花药培养相比较,花粉培养在某些方面具有一定的优越性。
如花粉培养不存在花药中的有害物质,不影响小孢子启动第一次分裂;排除了药壁、药隔、花丝的干扰,从小孢子中获得的材料是纯合的;小孢子能均匀地接触化学和物理诱变因素,是研究吸收、转化和诱变的理想材料;小孢子培养可观察到雄核发育的全过程,是很好的遗传和发育研究的材料体系;小孢子培养可以从每个花药中获得更多的单倍体。
花粉培养需将花粉从花药中分离出来,以单个花粉粒作为外植体进行离体培养。
所以与花药培养相比,花粉培养前必须进行花粉的分离与纯化。
4.1花粉分离与纯化方法
将小孢子从花药里游离出来的主要方法有自然散落法、挤压法和机械游离法。
(1)自然散落法将合适的花蕾消毒后,无菌条件下取出花药,接种在预处理液或培养基上。
一段时间后,有些花粉囊自动裂开,里面的小孢子从裂口处散落到培养基中,收集这些脱落下来的小孢子,用新鲜培养基制成一定密度后进行培养。
所以,此法又称漂浮培养散落小孢子收集法。
此法操作简单,不需专门仪器,并且可以连续收集,曾被不少研究者在水稻、大麦、小麦、玉米上成功采用,但效率低,易受花药组织影响。
(2)挤压法挤压法分为两种:
①直接挤压法。
消毒处理过的花药置于无菌培养皿或烧杯中,加入少量提取液,用注射器内管或一端压扁的玻璃棒轻压花药,将花粉挤到提取液中,经级联过筛,除去比小孢子大的组织碎片,然后低速离心,使小孢子沉淀,清洗几次后,制成小孢子悬浮液用于培养。
此法简便易行,不需专门装置,也可对单花蕾或花药进行少量分离,所以直到近年仍在芜菁、结球甘蓝、大麦、小麦、玉米、水稻等作物上采用。
不过,此法不适宜大规模游离小孢子的操作,并且重复性受不同操作人员用力大小、时间长短等因素影响。
②研磨过滤收集法。
与挤压法相似,不同之处是把消毒过的花蕾置于无菌的研钵中研磨,挤出小孢子。
甘蓝、大白菜、小白菜、红菜苔的小孢子培养主要采用此法。
(3)机械游离法此法也分为两种:
①磁搅拌法。
是将花药接种于盛有培养液或渗透压稳定剂的三角瓶中,放入一根磁棒(为提高分离速度,可另加入几颗玻璃珠),置磁力搅拌器上,低速旋转至花药透明。
该法分离花粉比较彻底,但对花粉有不同程度的机械损伤,且所需时间长,所以至今用得不太普遍。
②小型搅拌(超速旋切)法。
小型搅拌器的雏形就是厨用搅拌混合器。
不过,刀具、容器室、容器盖均用不锈钢或耐高温的塑料制成,以便对容器进行灭菌操作。
现在在控时、控速方面得到了进一步改进,并发展出可以更换的多种转轴型号,其基本原理是通过旋转刀具的高速转动带动花蕾、穗子切段或花药高速运动而破碎,从而使小孢子游离出来。
机械上装有调速器和时间控制器(有的还有实际转速显示器),操作方便,重复性好,可一次处理大量材料。
如油菜的花序,玉米、大麦、小麦的雄穗切段等均可直接放入容器中进行处理。
此外,提取小孢子所需时间短,获得率高,成活率也较高。
目前不但在油菜上被广泛采用,而且还逐渐被用于玉米、大麦、小麦等禾谷类作物。
(4)小孢子分离和纯化无论哪一种方法提取的小孢子匀浆,都需经过去除杂质的过筛、离心收集等步骤。
特别当采用花序或穗切段时,杂质甚至比小孢子量还要多。
不同物种甚至同一物种不同品种所用的筛子孔径由于小孢子的大小不同而有所不同。
采用级联过筛时,第一级可以选用孔径较大的,以便使大杂质去除,最后一级应选用略大于小孢子直径的筛子。
过筛后经过离心收集小孢子群体,一般在80~300g条件下进行。
不过由于各种作物小孢子的密度不同,需要经过摸索调整后才能获得理想的小孢子得率和成活率。
一些研究中使用聚果糖(percoll)或聚蔗糖(ficoll)甚至蔗糖配成不连续梯度对得到的小孢子群体进行纯化,以获得同步性较高的群体。
如Joersbo等(1990)对大麦小孢子群体用Percoll梯度纯化,结果为:
成活率高达70%的小孢子处于0/20%梯度界面;20%/30%界面的小孢子存活率只有4%;30%以上的只有碎片和已死的小孢子。
4.2花粉培养方式
(1)平板培养(platecultivationmethod)花粉置琼脂固化培养基上进行培养,诱导产生胚状体,进而分化成植株。
(2)液体培养花粉悬浮在液体培养基中进行培养。
由于液体培养容易造成培养物的通气不良,影响细胞分裂和分化,可将培养物置于摇床上震荡,使其处于良好的通气状态。
(3)双层培养花粉置固体一液体双层培养基上培养。
双层培养基的制作方法为:
在培养皿中铺加一层琼脂培养基,待其冷却并保持表面平整,然后在其表面加入少量液体培养基。
(4)看护培养(nursecultivationmethod)配制好花粉粒悬浮液和琼脂固体培养基后,将完整的花药或花药的愈伤组织放在琼脂培养基上,将圆片滤纸放在花药或愈伤组织上,然后将花粉置于滤纸的上方。
应用此法培养番茄花粉形成了细胞无性繁殖系。
(5)微室培养(microchamberculturemethod)将花粉培养在很少的培养基中。
具体做法是:
把悬浮花粉的液体培养基用滴管取一滴滴在盖玻片上,然后翻过来放在凹穴载玻片上密封。
这种培养方法的优点是便于培养过程中进行活体观察,可以把一个细胞生长、分裂、分化及形成细胞团的全过程记录下来。
缺点是培养基太少,水分容易蒸发,培养基中的养分含量和pH都会发生变化,影响花粉细胞的进一步发育。
应用这个方法曾诱导油菜花粉形成多细胞团,但未能继续发育。
(6)条件培养基培养(conditionedmediummethod)在预先培养过花药的液体培养基中或在加入失活的花药提取物的合成培养基中,接入花粉进行培养。
前者的做法是:
将发育时期合适的花药接种在合适的培养基上一段时间后,去掉花药并离心清除散落在培养基中的花粉,用所得上清液(即条件培养基)再培养合适的花粉。
后者的做法是:
首先将花药接种在合适的培养基上一段时间(如1周),然后将这些花药取出浸泡在沸水中杀死细胞,用研钵研碎,倒人离心管离心,上清液即为花药提取物。
提取液过滤灭菌后,加入培养基中,再接种花粉进行培养。
由于条件培养基和失活的花药提取物中含有促进花粉发育的物质,有利于花粉培养成功。
5壮苗和移栽
花粉植株非常娇嫩,很难移植。
需采取逐步过渡的方式,使其适应从异养到自养。
以小麦为例,王培等采用的方法是:
将已长出2~3片叶的花粉植株转入含有多效唑3mg/L,NAA和KT各0.5mg/L,LH(水解乳蛋白)500mg/L和蔗糖8%的MS培养基上,于22~25℃下进行壮苗培养,然后在3~8℃低温弱光条件下越夏,深秋时炼苗移栽。
移栽的关键是保持高空气湿度(80%~90%,1~2周)和低土壤湿度。
6禾谷类植物花药培养中白化苗的形成
在禾谷类植物花粉单倍体生产中存在的一个严重问题是出现大量白化苗。
在大麦、小麦和水稻的花粉植株中,白化苗通常要占总苗数的1/3以上,严重的情况下,白化苗频率可高达60%~90%,这就大大限制了花药培养技术在育种实践中的应用。
和绿苗相比,花粉白化苗除了缺乏绿色外,并无其他明显的形态学变异。
但是,花粉白化苗因没有发育完好的叶绿体,缺乏叶绿素,只能在异养条件下生长一段时间,很难开花结实,这给其遗传研究带来了难以克服的困难。
6.1白化花粉植株的亚微结构特征
根据对小麦花药培养中白化苗的研究,小麦花粉绿苗和花粉白化苗虽在形态、营养生长和染色体倍性上无明显差异,但白苗的生殖生长和雌蕊发育均不正常,在离体培养条件下,它不能完成有性世代和产生种子。
在花粉白化苗的细胞中,常发现有微核存在,叶肉细胞的细胞质中,存在着原质体,质体早期发育正常,但发育到一定阶段即停止发育,在质体中缺乏核糖核蛋白体。
某些胚性花粉粒和白苗的茎段分生细胞中出现染色体断片和微核。
6.2白化苗产生的影响因素及机理
几乎所有的研究者都发现内部因素和外部因素均可在一定程度上影响花粉植株的白苗率。
内部因素有供体植株的基因型、花药和花粉本身的状态;外部因素有低温预处理、培养基成分、生长激素水平和种类、培养条件和方法、愈伤组织转分化时间等。
在内部因素中,基因型和花粉发育时期的影响最为明显;在外界因素中,用28℃以上高温和高浓度2,4-D进行诱导培养,延迟愈伤组织转分化培养,可明显地促进花粉白苗发生。
而花药4~10℃低温预处理适当时间,可减少白化苗发生,提高绿苗率。
在小麦的花药培养中,要想获得高频率的花粉愈伤组织,就需要高浓度的蔗糖,但使用高浓度的蔗糖会提高花药培养中的白苗率。
质体DNA的缺失可能是出现白化苗的直接原因。
从小麦的花粉白苗和绿苗中提取出较完整的DNA相比较,结果表明:
白苗质体DNA有相当大的一段易缺失区域,白苗质体DNA的相对分子质量、含量都比绿苗少得多,如相对分子质量仅及正常质体DNA相对分子质量的1/4,质体DNA在总DNA中的比例仅为绿苗的1/6。
这些结果都说明小麦花粉白苗的质体DNA是不健全的。
缺失基本上都发生在植株再生的过程中,因为诱导再分化之前的愈伤组织内的质体基因组还保持完整。
核基因是控制花药培养力(包括绿苗率)的关键因素。
小麦花粉白苗发生是由核基因控制的,或是由核DNA变异引起的。
核基因可能是通过控制花粉质体变态,质体DNA结构改变、缺失过程发生的迟早、快慢、程度和频率而影响花粉白苗发生的。
这一推测可解释基因型的差异和通过一些措施可以降低白苗发生、提高花粉绿苗率的原因。
一些研究者认为,离体培养中高频发生的体细胞无性系变异是花粉白苗大量出现的原因之一。
6.3白化苗的控制
李景崎等(2002)研究发现,小麦花药培养技术中,通过采取一些措施可减少或阻止白苗发生,提高花粉绿苗率:
①采穗时主要取主茎和大分蘖穗,取花粉发育时期处于单核中晚期的幼穗。
镊取花药接种时,幼穗穗轴中部花药全取,下部多取,上部少取。
②幼穗4℃低温离体预处理24h。
③脱分化培养一般在暗室进行,温度30~32℃时,出愈率较高,但白苗多。
在29℃条件下培养,效果较为理想。
④脱分化培养基一般情况下用2.0mg/L的2,4-D与0.5mg/L的KT或6-BA配合使用。
⑤诱导愈伤组织分化阶段,把培养基的碳源由11%蔗糖改为9%蔗糖+2%麦芽糖。
⑥前期产生的愈伤组织分化能力较强,后期产生的愈伤组织分化能力降低,白苗率相对较高,所以出愈后应提早进行转分化培养。
为了找出减少白化现象的有效办法,还有待进一步的研究。
所幸的是,除葡萄外,在禾本科以外植物的花药培养中未曾发现过白化苗,在禾本科植物体细胞再生植株中,虽偶有白化苗出现,但频率很低。
7影响雄核发育的因子
7.1基因型
植物基因型是影响花药离体培养诱导单倍体成功的最重要的因素之一。
迄今为止,花药培养的成功主要局限于3个科的植物—茄科、禾本科和十字花科。
由此可见,花药对离体培养的反应在很大程度上受基因型的影响。
即使是同一科、属的植物,在不同物种间也存在巨大的差异,如据Irikura(1975)报道,在属于茄属的46个物种和9个种间杂种中,只有19个物种和4个杂种能产生花粉植株。
另据陈锦骅等(1982)报道,水稻不同种、亚种和品种间花药对离体培养反应的高低顺序是:
糯型、粳×籼杂种、粳型、籼型杂交稻、籼型。
在粳稻中花粉愈伤组织诱导率平均可达10%,而在籼粳中只有1%~2%。
烟草属各个种的花药对离体培养反应最灵敏,花粉植株的获得率最高,但是其中的郎氏烟草(Nicotianalongsdorffii)花药培养却很难成功。
7.2植株生理状态和生长条件
供体植株的年龄及其所处的生长条件(如光周期、光强、温度和矿质营养)也能影响花药对离体培养的反应。
一般来说,幼年植株的花药反应能力较好。
在开花末季采集的花药不但形成孢子体的频率很低,而且发生反应的时间也较迟。
在水稻和小麦等禾谷类植物中,大田植株比温室植株、主茎穗比分蘖穗花粉愈伤组织的诱导率高。
在烟草中,
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