细粒棘球绦虫成虫全长cDNA质粒文库的构建及鉴定.docx
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细粒棘球绦虫成虫全长cDNA质粒文库的构建及鉴定
细粒棘球绦虫成虫全长cDNA质粒文库
的构建及鉴定
(作者:
单位:
邮编:
)
作者:
吕刚,芦亚君,范志刚,史大中,王虎,韩秀
【摘要】目的:
构建细粒棘球绦虫(E.g.)成虫全长cDNA质粒
文库,并检测文库质量。
方法:
提取E.g.成虫mRNA应用SMAR方法构建pBluescriptIISK全长cDNA质粒文库,检测文库的重组率及容量;用载体克隆位点两端的引物进行PCRT增,检测插入片段大小。
随机挑选阳性重组克隆5’端测序,归并unigene,计算unigene得率,全长性判定主要根据同源全长基因5'末端进行比较判定并计算全长率。
结果:
成功构建E.g.成虫全长cDNA质粒文库。
文库的重组率为95.04%,库容量1.13X106;平均插入片段长度约为1.2kb。
24个随机阳性克隆测序,unigene比例为69.57%,全长性比率为
64.71%。
结论:
成功构建E.g.成虫全长cDNA质粒文库,文库质量良好。
【关键词】细粒棘球绦虫;成虫;全长cDNA质粒文库;构建;鉴定
[ABSTRACTObjective:
Toconstructandevaluate
fullMLengthcDNAlibraryofadultEchinococcusgranulosus
(E.g.).Methods:
mRNAwasextractedfromtheadultE.g.andusedfortheconstructionoffull拟、lengthcDNAlibraryusing
SMARTpBluescriptIISKkit.Therecombinationrateand
capabilityofthelibrarywasmeasuredandthelengthofinsertfractionofthepositiverecombinantcloneswastestedbyPCR.
Positiverecombinantcloneswererandomlyselectedfor5'endsequencingandtheratesofunigene,full扌!
):
lengthcDNAwas
analyzedbyESTdatausingbioinformatics.Results:
The
full松丿:
lengthcDNAlibrayofadultE.g.wasconstructedsuccessfully.Therecombinationrateandcapabilityofthelibrarywere95.04%and1.13x106,respectively.Theaveragelengthofinsertfractionwasabout1.2kb.24recombinant
clonesrandomlyselectedweresequeneed,therateofunigeneandfull拟lengthcDNAwere69.57%and64.71%.Conclusions:
Ahigh拟qualityoffullMlengthcDNAplasmidlibraryofadultE.g.hasbeenconstructedsuccessfully.
[KEYWORDSEchinococcusgranulosus;Adult;
Full拟lengthcDNAplasmidlibrary;Construction;Evaluation
细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus,E.g.)成虫寄生于犬科动物小肠,其中绦期幼虫细粒棘球蚴(包虫,echinococcuscyst/hydatidcyst)寄生在中间宿主偶蹄类家畜(羊、牛、马等)
及人的多种器官、组织内,引起以占位性病变为主要临床表现的囊型包虫病(cysticechinococcosis,CE,是一种严重危害人类健康和畜牧业生产的人畜共患寄生虫病。
CE分布于世界许多国家的牧区,我国是CE的主要流行区之一,主要分布于西北牧区。
CE是我国乃至
世界一个重要的公共卫生及经济问题[1],已被列入我国十一五重大寄生虫病防治项目。
疫苗及早期诊断是其防治的关键,目前尚无成熟的疫苗及诊断试剂。
该虫的基因组学及功能基因组学尚未开展,已知
基因甚少,不利于对相关基础问题的研究,更不利于相关疫苗、诊断试剂及药物的研究。
本研究目的在于通过构建E.g.成虫全长cDNA质粒文库并对文库质量进行鉴定,为大规模表达序列标签(expressedsequenee
tag,EST测序,开展基因表达谱分析,克隆和鉴定一批功能基因全长cDNA序列,并为开展重要基因的功能研究打下基础。
1材料与方法
1.1材料与试剂
E.g.成虫标本采自青海省西宁市人工感染犬小肠,用灭菌生
理盐水漂洗3次后液氮冻存。
试剂:
Trizol总RNA提取试剂盒、1kbDNA梯度标记物为GIBCOBRL公司产品;SMARTIV寡核苷酸,CDS
HI/3JPCR引物,pBluescriptIISK的改造载体(将EcoRI和Not
I之间的序列改造为SfiIA和SfiIB接头序列),由上海联合基
因公司合成和提供;DH):
5a感受态菌,通用合成引物M13+/M13:
异丙基拟B拟D):
硫代半乳糖苷(IPTG)和x拟gal为上海生工生物工程技术有限公司产品;质粒抽提试剂盒,荷兰QIAGEN公司产品;
DYEnamicTMETDYETerminatorKit(MegaBACETM为美国AmershamBiosciences产品;Milli拟Q水纯化系统,美国Millipore公司产品;SpectraMaxPlus384连续波长酶标仪,美国MolecularDevices公司产品;F^D;280电泳仪,上海复日公司产品;HYBAIDPCREXPRESS
PCF仪,英国ThermoHybaid公司产品;ABIPRISM3700测序仪,美国PEABI公司产品。
1.2方法
1.2.1全长cDNA质粒文库的构建
121.1样品总RNA抽提及mRN纯化
按提取试剂盒操作说明书抽提总RNA产物,于260nm及280nm测吸光度(A260及A280),计算A260/A280比值判定纯度(纯RNAA260/A280=1.9-2.1),1.1%琼脂糖电泳检测RNA完整性。
根据QIAGEN^司的OligotexmRNAKits操作说明书进行分
离,A260及A280检测及1.1%琼脂糖电泳检测抽提结果。
1.2.1.2cDNA第一链合成
0.5mL灭菌离心管中加入以下试剂:
2卩g样品RNA1卩LSMART
IVOligonucleotide,1卩LCDSIII/3'PCRPrimer,加水补足5
卩L,混匀试剂并稍离心,72C温浴2min,冰浴2min,稍离心后加入下列试剂:
2.0卩L5xFirst拟StrandBuffer,1.0卩LDTT(20mmol/L),1.0卩LdNTPMix(10mmol/L),1.0卩LPowerScriptReverseTranscriptase,总反应体系为10.0卩L,混匀试剂并稍离心,42C温浴1hr,将离心管置于冰上终止第一链合成。
1.2.1.3LDPCR扩增cDNA
将PCF仪预热至95C,反应管中加入下列试剂:
2卩LcDNA第一链,80卩L去离子水,10卩L10xAdvantage2PCRBuffer,2卩L50xdNTPMix2□L5'PCRPrimer,2LCDSIII/3'PCRPrimer,2□L50xAdvantage2PolymeraseMix,总反应体系100卩L。
轻拍混匀,稍离心后置于已预热PCF仪,按下面程序开始PCR95C1min,26cycles;95C15sec,68C6min。
循环结束后取5卩L样品1.1%琼脂糖电泳检测。
1.2.1.4PCR产物纯化
合并LDU.PCF产物至0.5mL菌离心管中,加入2卩L蛋白酶K(20卩g/卩L),混匀试剂并稍离心,45C温浴20min,离心,加入50卩L去离子水,100卩L酚:
氯仿:
异戊醇抽提,17530Xg离心5min,收集上层液体转移至另一干净离心管中,加入等体积的氯仿:
异戊醇
混匀,离心5min,转移上层液体,加入1/10体积3mol/L乙酸钠,2.5倍体积95%室温乙醇,室温条件下立即17530Xg离心20min,去上清,100卩L80%乙醇洗沉淀物,空气干燥约10min,加79卩L去离子水溶解沉淀。
1.2.1.5SfiI消化
0.5mL离心管中加入下列试剂:
79卩LcDNA,10卩L10xSfi
Buffer,10卩LSfiIEnzyme,1L100xBSA加去离子水补充体
积至100卩L。
充分混匀,50C温浴2h。
加2卩L1%二甲苯胺染料。
121.6cDNA的分级分离
备11个收集管,700卩L缓冲液清洗spin拟400柱子后将酶切产
物约100卩L平稳加于胶层中间,直至产物全部渗到胶面下。
加100卩L缓冲液使染料层下降数毫米,放置好第一收集管。
加600卩L缓冲液并开始收集滴出液体,每管收集35卩L。
合并第2〜7管,拟.20C乙醇沉淀过夜。
17530Xg离心20min,弃上清,室温干燥10min,加7口L去离子水溶解沉淀,1.1%琼脂糖电泳检测。
1.2.1.7cDNA与pBluescriptIISK改良载体相连
反应管中加入下列试剂:
1.0卩LcDNA,1.0卩LVector(25
ng/mL),1.0卩L10xLigationBuffer,1.0卩LATP(10mmol/L),1.0□LT4DNALigase,加去离子水5.5卩L至10.0卩L,16CPCR仪上过夜。
1.2.1.8重组质粒的转化
按常规方法取1卩L连接液转化200卩L感受态大肠埃希菌DH',5
a。
1.2.2文库质量的鉴定
1.2.2.1质粒文库的容量及重组率
转化后的菌液涂布于15cm培养皿(Apr拟IPTG/x拟galLB固体培
养基),37C过夜。
计数菌落总数和蓝色菌落数,计算质粒文库的容量和重组率。
重组率二(菌落总数拟蓝色菌落数)/菌落总数X100%库容量二菌落数X连接产物量。
1.222插入片段大小
随机挑取12个阳性克隆,以通用载体引物M13+般PCR扩增,
扩增产物1.1%琼脂糖凝胶电泳,计算插入片段平均长度。
1.2.2.35'端EST测序及测序结果的unigene、全长性判定随机挑取24个阳性克隆,送上海联合基因科技有限公司进行测序。
>450bp的序列作为有效序列,使用Washington大学wU以blast程序(2.0a19MP)对测序结果进行同源性分析。
依据100bp95%勺标准进行归并为
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- 关 键 词:
- 细粒 绦虫 成虫 全长 cDNA 质粒 文库 构建 鉴定