整理冰冻切片实验步骤..docx

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全部实验步骤

1取新鲜组织于4%多聚甲醛固定24小时

230%蔗糖脱水48小时以上

3-250C包埋（冰冻切片机内）

4冰冻切片冰冻切片步骤

冰冻切片免疫组化染色步骤：

冰冻切片4~8μm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3次。

用3%过氧化氢孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。

PBS冲洗，5分钟×2次。

下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤。

（见我发的前面的帖子）

你确定你是冰冻切片吗？

？

？

冰冻切片不能用热修复啊！

！

！

以下是我的步骤：

1冰冻切片室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。

用3％过氧化氢孵育

5~10分钟，PBS洗，5分钟×2。

25~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。

倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。

3PBS冲洗，5分钟×3次。

4滴加滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育30分钟。

PBS冲洗，5分钟×3次。

5滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。

6PBS冲洗，5分钟×3次。

7显色剂显色（DAB）。

8自来水充分冲洗，复染，封片。

冰冻切片免疫组化染色用的灭活内源性过氧化物酶，最好是用3%H2O2/甲醇溶液，室温20分钟。

此配方不易产生脱片。

配制方法是在9ml甲醇中加30%H2O21ml，混匀后使用，每次新鲜配制。

冰冻切片免疫组化染色步骤

冰冻切片4~8mm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。

用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。

PBS洗，5分钟×2。

下接免疫组化染色操作步骤。

免疫组化染色步骤：

（SP试剂盒为例）

1冰冻切片4~8um，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。

用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。

PBS洗，5分钟×2。

25~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。

倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。

3PBS冲洗，5分钟×3次。

4滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。

PBS冲洗，5分钟×3次。

5滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。

6PBS冲洗，5分钟×3次。

7显色剂显色（DAB或AEC）。

8自来水充分冲洗，复染，封片。

1.冰冻切片4um左右，室温25°C复温30min，浸入4°C预冷的丙酮固定10min，

2.PBS（PH为7.2-7.4）在9cm皿内摇床冲洗3次，每次5min（第一次冲洗时间短些，约

1min后更换）

3.用3%过氧化氢一份，纯甲醇50份（需要现配，避光条件封闭，可以用纸盒盖住皿）

30min。

4.PBS（PH为7.2-7.4，酸性）在9cm皿内摇床冲洗3次，每次5min（第一次冲洗时间短些，约1min后更换），甩去PBS，擦干切片周围的水分，用免疫组化笔或蜡笔在组织周

围画一适当大小的圈，距离组织不宜太近，与切片组织保持5mm左右距离，太近会导

致边缘效应。

5.5%BSA，室温孵育20min，期间注意观察，以免BSA干燥而导致背景太高，请注意在皿内玻片两侧放置浸湿的卫生纸或棉球。

6.甩去血清，PBS洗1min，擦干周边水分，圈内可不擦，但尽量要甩干，以免导致抗体浓度不均。

7.配置一抗工作液用5%BSA（抗体浓度为1:

100），悬空加入一抗工作液50-100ul，枪头

不要触及组织，以免损伤组织结构，滴加一抗后在水平桌面画圈方式振荡，混匀一抗，否则抗体可能附着不匀。

8.放入湿盒内，置于4°C冰箱过夜（最长不可超过48h），注意盖盖，放入后观察玻片是否处于水平位（否则抗体可能流失，导致玻片组织干掉，出现背景高和假阳性），孵育期间观察抗体是否干，若干了赶快用PBS清洗浸泡。

9.第二天上午取出玻片，置常温复温30min，后PBS冲洗1+5+5+5min，

10.滴加1:

100生物素标记的二抗（注意选择核对一抗来源，抗体加入稀释后在EP管内弹

匀，掌上离心机离心）室温孵育30min-1h，后PBS冲洗1+5+5+5min。

11.滴加1:

100比例稀释的辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素PBS稀释液（SABC）室温

1h，后PBS冲洗1+5+5+5min，甩干，以免显色不均。

12.DAB显色，显色时放置在白色纸上，观察显色程度以终止DAB反应，最好把玻片置于显微镜上找到可能的阳性显色区域滴加DAB，观察到阳性区和阴性区差异后终止，此时最好有计时，以便于今后重复试验控制显色时间（一般显色时间2s-10min，显色时间过长背景高，且可靠性低）

13.终止DAB显色可将玻片置于染色缸内，用自来水流水稀释终止5min，后在显微镜下观

察是否有DAB颗粒附着。

14.甩干水分，苏木素复染（如为加汞的苏木素，显色时间为6-10s，可不用酒精分化，直接用PBS返蓝，如为非加汞苏木素，需在盐酸酒精分化），苏木素终止亦可用自来水冲洗终止反应。

15.水洗后梯度酒精脱水二甲苯透明（75%-85%-95%-100%-100%-二甲苯1-二甲苯2）个

3min，滴加中性树胶封片，中性树胶浓度以不拉丝为宜

16.封片后干燥1h（或者在通风橱吹风的情况下15min），用棉球沾湿二甲苯擦去溢出的树胶。

观察照相。

针对脱片问题，我做了如下处理。

但仍存在脱片现象，麻烦您给我提一些相关的建议。

自来水冲洗玻片，晾干后，多聚赖氨酸的涂胶以下两种方法我都试过

1.单涂胶：

往一张玻片上加0.01%的多聚赖氨酸80ul，用另一张玻片推片，然后叠加其上，停留5分钟，中间推动玻片数次，使液体涂抹均匀，分开两张玻片，滤纸吸干玻片下缘，置玻片架上600C烤干1h备用。

2.双涂胶：

往一张玻片上加0.01%多聚赖氨酸80ul,单涂胶600C烤干,同样方法重

复涂胶1次"600C烤干,备用。

我用过的尼氏染色的方法，效果不错。

1.溶液配制：

（1）溶液A：

焦油固紫0.2g,纯水500ml

（2）溶液B：

0.1M冰醋酸冰醋酸3ml，纯水500ml

（3）溶液C：

0.1M无水醋酸钠无水醋酸钠4.1g，纯水500ml

（4）溶液D：

PH3.5~4.5醋酸缓冲液B液94ml＋C液6ml

（5）工作液：

A液10ml＋D液90ml过滤后使用，避光保存

注：

焦油固紫遇光分解，整个过程应避光操作，可以用黑色塑料袋罩着。

2.具体步骤：

⑴如果为石蜡切片，先进行脱蜡处理，然后从步骤⑵开始；如果为冰冻切片，从步骤⑵开始。

⑵将凉干的切片放入纯水中3～5min。

⑶切片放入焦油固紫染色液中1～1.5h。

⑷切片放入纯水中洗去浮色。

⑸切片放入70％－80％－95％的酒精分色，各几秒钟，时间自己掌握，以不见掉色为好。

⑹切片放入特殊分色液中褪背底（1：

1：

1的无水乙醇，氯仿，乙醚）。

⑺切片放入100％乙醇，5min×3次；二甲苯5min×3次，透明封固。

整个过程要保证切片不能干掉。

3、结果

尼氏小体：

深蓝紫色；核、核仁：

浅紫色；背底：

洁白无色。

我个人觉得特殊分色液挺重要的

Highman甲醇刚果红染色法（类淀粉染色）

1、试剂配制：

甲醇刚果红染液:

刚果红0.5g甲醇80ml甘油20ml

碱性乙醇分化液:

氢氧化钾0.2g80%乙醇100ml

2、染色步骤:

（1）切片脱蜡至水

（2）甲醇刚果红染液染10～20分钟

（3）用碱性乙醇分化液分化数秒

（4）水洗

（5）苏木素复染2分钟

（6）水洗

（7）脱水,透明,封固

3、结果：

淀粉样物呈桔红色。

4、类淀粉染色的应用：

确定淀粉样变性及玻璃样变性的胶原组织，后者在刚果红法染色后呈淡桔色，

冰冻切片脱脂问题：

0.5盐酸乙醇分化液配置

直接免疫荧光法测抗原基本原理

将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。

其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光

染色少。

缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。

此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。

试剂与仪器

l磷酸盐缓冲盐水（PBS）：

0.01mol/L，pH7.4

l荧光标记的抗体溶液：

以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释

l缓冲甘油：

分析纯无荧光的甘油9份+pH9.20.2M碳酸盐缓冲液1份配制

l搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS1500ml）

l有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）

l荧光显微镜

l玻片架

l滤纸

l37℃温箱等。

实验步骤

1.滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。

2.滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：

30min）。

3.取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的

PBS三缸浸泡，每缸3-5min，不时振荡。

4.取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。

5.立即用荧光显微镜观察。

观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：

（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++--

++++）荧光闪亮。

待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。

注意事项

1.对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1：

20，抗体浓度

过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。

2.染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10min到数小时，一般30min已足够。

染色温度多采用室温（25℃左右），高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长染色时间。

低温染色过夜较37℃30min效果好的多。

3.为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。

（1）标本自发荧光对照：

标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。

（2）特异性对照（抑制