丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌体外混合培养对肠道致病菌的影响.docx
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丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌体外混合培养对肠道致病菌的影响
丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌体外混合培养对肠道致病菌的影响
[摘要]本试验研究了丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌混合培养对肠道中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌和大肠杆菌4种致病菌的影响。
结果表明:
丁酸梭菌对这4种菌均有明显的抑制作用,可使其菌落数下降3~5个数量级;鼠李糖乳杆菌可降低产气荚膜梭菌、沙门氏菌菌落数;丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌混合培养可使4种致病菌菌落数均下降3~4个数量级。
由此可见,两种菌混合培养对4种病原微生物的抑制无协同作用。
[关键词]丁酸梭菌;鼠李糖乳杆菌;混合培养;肠道致病菌
[Abstract]ThisexperimentwasconductedtostudytheeffectsofthemixedcultureofClostridiumbutyricumandLac-
tobacillusrhamnosusonintestinalpathogens,includingSalmonellagallinarum,Staphylococcusaureus,Clostridiumperfrin-
gensandEscherichiacoli.Theresultsshowedthat:
theClostridiumbutyricumsignificantlyinhibitedthenumberofthese
fourtypesofbacteriaandmadethemdown3~5ordersofmagnitude;LactobacillusrhamnosusreducedClostridiumper-
fringens,Salmonellagallinarumcolonies;themixedcultureofClostridiumbutyricumandLactobacillusrhamnosusmade
fourkindsofbacteriadown3~4ordersofmagnitude.Theresultsindicatedthatthemixedcultureofstrainshadnosyner-
gisticinhibitioneffectonthefourkindsofpathogenicmicroorganisms.
[Keywords]Clostridiumbutyricum;Lactobacillusrhamnosus;mixedculture;entericpathogens
丁酸梭菌属于梭菌属,是一种专性厌氧的革
兰氏阳性芽孢杆菌,其广泛分布于土壤,也能从
健康动物的肠道中分离出来。
丁酸梭菌适合动物
的肠道厌氧环境(呼慧娟等,2011),可以控制消
化道紊乱(张晓阳等,2012),有效抑制有害菌(曹
广添等,2012)。
鼠李糖乳杆菌属于乳杆菌,具有
较强的酸及胆碱耐受能力(王玉华等,2008),有
抑制有害菌的作用(吴光伟和韩建春,2009),具
有抗氧化活性,并且可以影响机体免疫功能。
目
前丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌均被广泛用作饲料
添加剂,本试验研究了丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌
联合培养对产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、沙
门氏菌、大肠杆菌的抑制作用,为微生物制剂联
和使用提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1菌种、试剂及培养基丁酸梭菌(Clostridi-
umbutyricum,HJCB998),由浙江惠嘉生物科技有
限公司提供;鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamno-
sus,ATCC7469)、产气荚膜梭菌(Clostridiumper-
fringens,ATCC13124),均由广东省微生物菌种保
藏中心提供;大肠杆菌C83928(Escherichiacoli
C83928)、沙门氏菌(Salmonellagallinarum,C79)、
金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureaus,
SHZ018),均由浙江大学动物科学学院研究室提
供。
琼脂、氯化钠为分析纯。
厌氧液体培养基、LB
液体培养基、LB琼脂培养基、强化梭菌培养基
(RCM)、DRCA梭菌选择性培养基、伊红美蓝培养
基(EMB)、乳酸细菌培养基(MRS)、BP培养基、
HE培养基、SC培养基,均购自北京陆桥生物科技
有限公司。
1.1.2主要仪器与设备厌氧培养箱、灭菌锅、恒
温培养箱、培养皿、超净工作台、试管、接种环等。
1.2试验方法
1.2.1菌种活化丁酸梭菌活化:
将冻干管保藏
菌株接种于装有梭菌液体培养基的试管中,置于
厌氧培养基中37℃静止厌氧培养48h,取0.1mL
转接装有9.9mL厌氧液体培养基的试管,厌氧静
止培养16h。
产气荚膜梭菌及鼠李糖乳杆菌活化:
在超净
台内,取一定量的无菌水迅速加入打开的冻干管,
轻轻将菌粉混匀溶解,然后将菌液分别转接LB
斜面及厌氧液体培养基,置37℃厌氧培养48h
后,取1环菌种接种于装有9.9mL厌氧液体培养
基的试管,厌氧静止培养16h。
1.2.2培养物的制备将活化好的0.1mL丁酸
梭菌、鼠李糖乳杆菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄
球菌、大肠杆菌、沙门氏菌分别接种于装有9.9mL
厌氧液体培养基的试管,丁酸梭菌、鼠李糖乳杆
菌、产气荚膜梭菌均于37℃厌氧静止培养24h,
其余肠道致病菌普通培养16h,并分别计数。
1.2.3混合培养取16个装有19.9mL厌氧液
体培养基的三角瓶,将活化的菌液稀释到10
4
~
10
5
cfu/mL,分组混合:
(1)丁酸梭菌与大肠杆菌按
浓度100∶1比例混合接种到三角瓶中;
(2)鼠李糖
乳杆菌、大肠杆菌按浓度100∶1比例混合接种到
三角瓶中;(3)丁酸梭菌、鼠李糖乳杆菌及大肠杆
菌按浓度100∶100∶1比例接种至三角瓶中;(4)将
等量的大肠杆菌接种于三角瓶中作为对照。
随后
置厌氧培养箱中37℃恒温静止培养。
活菌计数方法:
分别在培养的0、4、8、12、24、
36、48、72h取各组培养物样本,检测试验组与对
照组中各致病菌的数量(cfu/mL),并与单独培养
进行对比。
采用稀释平板计数法,将待测菌液摇
匀,每组分别取0.1mL样品进行10倍连续稀释,
选取适当稀释度的菌悬液0.1mL,分别滴加在伊
红美蓝选择性培养基平板上,每个稀释度3个重
复,置37℃培养48h后,计算其菌数后取平均值
(三个平板菌落总数/3×10×稀释倍数)。
由于丁酸
梭菌、鼠李糖乳杆菌是严格厌氧菌,在有氧情况下
无法长出,计数结果为准确的致病菌菌数。
丁酸梭菌和鼠李糖乳杆菌对产气荚膜梭菌、
金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的体外生物拮抗作用
研究方法同上。
选用的计数培养基分别为SC培
养基、BP培养基、HE培养基。
2结果与分析
2.1丁酸梭菌和鼠李糖乳杆菌对沙门氏菌的体
外生物拮抗作用从图1可以看出,培养12h
时,丁酸梭菌培养组沙门氏菌数量比沙门氏菌单
独培养有明显下降趋势,菌落数差别达2个数量
级,24h后菌落数差别达4~5个数量级。
鼠李糖
乳杆菌对沙门氏菌的抑制作用从24h开始比较
明显,菌落数差别为1~2个数量级。
丁酸梭菌与
鼠李糖乳杆菌混合培养时,沙门氏菌菌落数从
12h开始明显下降,24h后菌落数差别达3~4
个数量级,可见,两种菌联合培养对沙门氏菌的抑
制无协同作用。
2.2丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌对金黄色葡萄球
菌的体外生物拮抗作用从图2可以看出,丁酸
梭菌可以明显抑制金黄色葡萄球菌,从12h开
始,其菌落数比金黄色葡萄球菌单独培养时下降
2~4个数量级;鼠李糖乳杆菌对金黄色葡萄球菌
无明显抑制作用;丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌混合
培养时,从12h开始,金黄色葡萄球菌菌落数下
降2~3个数量级,两菌株混合培养对金黄色葡
萄球菌的抑制无协同作用。
时间
/h
金
黄
色
葡
萄
球
菌
数
量
/
l
g
c
f
u
图2丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌对
金黄色葡萄球菌的体外生物拮抗作用
沙
门
氏
菌
数
量
/
l
g
c
f
u
图1丁酸梭菌和鼠李糖乳杆菌对
沙门氏菌的体外生物拮抗作用
时间
/h
0481224364872
7
9
3
5
沙门氏菌
丁酸梭菌+鼠李糖乳杆菌+沙门氏菌
丁酸梭菌+沙门氏菌
鼠李糖乳杆菌+沙门氏菌
0481224364872
7
9
3
5
金黄色葡萄球菌
丁酸梭菌+鼠李糖乳杆菌
+金黄色葡萄球菌
丁酸梭菌+金黄色葡萄球菌
鼠李糖乳杆菌+金黄色葡萄球菌
102013年第21期中国饲料
2.3丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌对产气荚膜梭菌
的体外生物拮抗作用从图3可以看出,丁酸梭
菌对产气荚膜梭菌抑制作用明显,从8h开始,可
使菌落数下降2~5个数量级,在36h时抑菌效
果最明显;鼠李糖乳杆菌单独作用于产气荚膜梭
菌时,从12h开始,可使其菌落数下降2个数量
级以上;两菌株联合培养对产气荚膜梭菌的抑制
作用在24~48h时低于丁酸梭菌单独培养,其
他时间无显著差异。
2.4丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌对大肠杆菌的体外
生物拮抗作用从图4可以看出,丁酸梭菌能明显
抑制大肠杆菌,从8h开始,其菌落数比大肠杆菌
单独培养时低3~4个数量级;鼠李糖乳杆菌对大
肠杆菌无明显抑制作用;丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌
混合培养时,可以使大肠杆菌菌落数降低3~4个
数量级,并且抑菌曲线和丁酸梭菌大体一致,表明
两菌株混合培养对大肠杆菌的抑制无协同作用。
3讨论
丁酸梭菌是肠道正常微生物,可以调节肠道
菌群,抑制肠道有害菌。
研究表明,丁酸梭菌可以
对大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌均产生抑制
作用(曹广添等,2012;Yang等,2012;Cao等,
2012),降低产气荚膜梭菌在微生物群体中的比例
(Kong等,2011)。
丁酸梭菌可以产生有机酸降低
肠道pH从而抑制有害菌的生长(张晓阳等,
2012),同时丁酸梭菌及其脂磷壁酸也可以抑制有
害菌在细胞上的附着(Gao等,2012),另外丁酸梭
菌可以减轻艰难梭菌毒素蛋白的毒力并且降低该
菌的数量(Woo等,2011)。
本试验表明,丁酸梭菌
对产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大
肠杆菌的生长均有明显的抑制作用。
已有研究表
明丁酸梭菌通过产生丁酸、乙酸等短链脂肪酸,产
生细菌素,以及对营养物质黏附位点的竞争等途
径来抑制有害菌(张晓阳等,2012;Gao等,2012)。
鼠李糖乳杆菌具有很好的黏附性和抑菌性。
Mack等(1999)研究表明,鼠李糖乳杆菌可以体外
抑制大肠杆菌,除此之外,鼠李糖乳杆菌对志贺氏
菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、鸡白痢
沙门菌、肠杆菌、肠球菌等有害菌均有一定的抑制
作用(刘冬梅等,2005;魏华等,2001)。
刘冬梅等
(2006)研究表明,鼠李糖乳杆菌可以有效抑制有
害菌,其抑菌原因主要是产生了乳酸,改变了肠道
酸性环境,对有害菌产生抑制作用。
本试验表明,
鼠李糖乳杆菌可显著抑制沙门氏菌和产气荚膜梭
菌,而对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌无明显抑制
作用,这与之前研究结果略有不同,其原因有待进
一步研究。
随着益生菌制剂在畜牧生产中的大量应用,
单一益生菌应用效果的局限性也慢慢表现出来,
因此几种益生菌的联合发酵和联合使用成为益生
菌制剂发展的新趋势(冯树和张忠泽,1990)。
Stadie等(2013)研究表明,乳酸菌与酵母菌混合
培养,酵母菌释放精氨酸有助于乳酸菌生长。
双歧
杆菌与嗜酸乳杆菌混合培养时可加快产酸,双歧
杆菌可促进嗜酸乳杆菌增殖(张香美等,1999)。
丁
酸梭菌、肠膜芽孢杆菌、粪肠球菌三种菌的无细胞
上清液彼此之间均有促进生长作用(薛胜平等,
2008)。
丁酸梭菌与双歧杆菌体外共培养可以明显
抑制大肠埃希杆菌O157、痢疾杆菌F2a、伤寒杆
菌、艰难梭菌及产气荚膜梭菌的生长(吕存女等,
2011a、b)。
丁酸梭菌和婴儿型双歧杆菌对霍乱孤
菌有拮抗作用,并且其主要拮抗作用是由丁酸梭
菌引起的(陆俭等,2000)。
本试验结果也表明,丁
酸梭菌和鼠李糖乳杆菌联合培养时对产气荚膜梭
菌、沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均显示
出较强的生物拮抗作用,其中起主要作用的是丁
酸梭菌。
4结论
本试验结果表明,丁酸梭菌对产气荚膜梭菌、
产
气
荚
膜
梭
菌
/
l
g
c
f
u
图3丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌对
产气荚膜梭菌的体外生物拮抗作用
时间
/h
图4丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌对
大肠杆菌的体外生物拮抗作用
0481224364872
8
10
时间
/h
大
肠
杆
菌
数
量
/
l
g
c
f
u
4
6
大肠杆菌
丁酸梭菌+鼠李糖乳
杆菌+大肠杆菌
丁酸梭菌+大肠杆菌
鼠李糖乳杆菌+大肠杆菌
0481224364872
8
10
4
6
2
产气荚膜梭菌
丁酸梭菌+鼠李糖乳杆菌
+产气荚膜梭菌
丁酸梭菌+产气荚膜梭菌
鼠李糖乳杆菌+产气荚膜梭菌
11中国饲料2013年第21期
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[29]JooST,LeeJI,HaYL,etal.Effectsofdietaryconjugatedlinoleicacid
onfattyacidcomposition,lipidoxidation,color,andwater-holdingcapacityof
porkloin[J].AnimSci,2002,80
(1):
108~112.
[30]KarinN,KlausF,GerdN,etal.Effectsofdietaryoliveandlinseedoilon
lipidcomposition,meatquality,sensorycharacteristicsandmusclestructurein
pigs[J].MeatScience,2005,70:
63~74.
[31]LoughmillerJA,NelssenJL,Goodb,etal.Influenceofdietarytotalsulfur
aminoacidsandmethionineongrowthperformanceandcarcasscharacteristics
offinishinggilts[J].JAnimSci,1998,76(8):
2129~2134.
[32]MahanDC,ClineTR,RichertB.Effectsofdietarylevelofselenium-
enrichedyeastandsodiumseleniteasseleniumsources,fedtogrowing-finish-
ingpigsonperformancecharacteristics,andloinquality[J].JAnimSci,1999,77
(8):
2172~2179.
[33]MatthewsJO,HigbieAD,SouthernLI,etal.Effectofchromiumpropi-
onateandmetabolizableenergyongrowth,carcasstraits,andporkqualityof
growing-finishingpigs[J].JAnimSci,2003,81:
191~196.
[34]O’QuinnPR,SmithJW,NelssenJL,etal.Effectsofsourceandlevelof
addedchromiumongrowthperformanceandcarcasscharacteristicsofgrowing
finishingpigs[J].JAnimSci,1998,76
(2):
125.
[35]OkeudoNJ,MossBW.Interrelationshipsamongstcarcassandmeatqual-
itycharacteristicsofsheep[J].MeatScience,2005,69:
1~8.
[36]OlivaresA,DazaA,ReyAI,etal.Interactionsbetweengenotype,dietary
fatsaturationandvitaminAconcentrationonintramuscularfatcontentand
fattyacidcompositioninpigs[J].MeatSci,2009,81(4):
641~647.
[37]ShehonJL,PayneRL,JohnstonSL,etal.Effectofchromiumpropi-
onateongrowth,carcasstraits,porkquality,andplasmametabolitesingrow-
ing-finishingpigs[J].JAnimSci,2003,81:
2515~2524.
[38]WiegandBR,SparksJC,ParrishFC,etal.Durationoffeedingconjugat-
edlinoleicacidinfluencesgrowthperformance,carcasstrails,andmeatquality
offinishingbarrows[J].JAnimSci,2002,80:
637~643.
[通讯地址:
南昌市经济技术开发区枫林大
道,邮编:
330013]
金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌的生长均有
明显的抑制作用;鼠李糖乳杆菌可抑制沙门氏菌
和产气荚膜梭菌,而对金黄色葡萄球菌和大肠杆
菌无明显抑制作用;丁酸梭菌和鼠李糖乳杆菌联
合培养时对产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌、
金黄色葡萄球菌均显示出较强的生物拮抗作用,
但未表现出协同作用。
参考文献
[1]曹广添,刘婷婷,周琳,等.丁酸梭菌对致病菌和有益菌的体外作用效果
研究[J].中国饲料,2012,4:
16~19.
[2]冯树,张忠泽.混合菌-一类值得重视的微生物资源[J].中国食用菌,1990,9
(1):
4~7.
[3]呼慧娟,范小燕,周琳,等.不同氧需求特性菌株在模拟肠道厌氧条件下
的增殖[J].饲料工业,2011,32(20):
38~41.
[4]黄琴,黄怡,崔志文,等.鼠李糖乳杆菌对巨噬细胞先天性免疫应答的
调节作用[J].中国农业科学,2012,45(8):
1621~1626.
[5]黄怡,黄琴,李卫芬,等.鼠李糖乳杆菌对Caco-2细胞抗氧化功能和细
胞因子分泌的影响[J].畜牧兽医学报,2012,43
(2):
250~254.
[6]刘冬梅,李理,梁世中,等.鼠李糖乳杆菌产生抗菌物质的抑菌作用和特
性研究[J].中国乳品工业,2006,34
(1):
13~16.
[7]刘冬梅,李理,梁世忠,等.鼠李糖乳杆菌的抑菌及其在大豆奶酪中性质
研究[J].现代食品科技,2005,21(4):
6~10.
[8]陆俭,张雪平,孟筱琦.酪酸梭菌和婴儿型双歧杆菌对霍乱弧菌的拮抗
试验[J].微生物学通报,2000,27(5):
338~341.
[9]吕存女,邝欣,崔萱林.酪酸梭菌与婴儿型双歧杆菌对产气荚膜梭菌
试管内生物拮抗作用的研究[J].中国微生态学杂志,2001a,13
(1):
38~40.
[10]吕存女,邝欣,张雪平,等.酪酸梭菌与婴儿双歧杆菌对艰难梭菌体外
生物拮抗作用的研究[J].中国微生态学杂志,2001b,13(4):
222~224.
[11]王玉华,高晶,陈萍,等.鼠李糖乳杆菌不同组分抗氧化活性的研究[J].
食品科技,2011,36(9):
27~31.
[12]王玉华,高晶,冯印,等.鼠李糖乳杆菌耐酸及胆盐能力研究[J].食品科
学,2008,20(12):
449~451.
[13]魏华,徐锋,徐玉琴.鼠李糖乳杆菌的生物学特性及发酵性能研究[J].
食品与发酵工业,2001,27(9):
11~15.
[14]吴光伟,韩建春.鼠李糖乳杆菌(ATTC53103)产细菌素的研究[J].东北
农业大学学报,2009,40(8):
81~85.
[15]薛胜平,杜连祥,路福平.三种益生菌混合培养及共生机理研究[J].工业
微生物,2008,38
(2):
28~32.
[16]张香美,江汉湖,董明盛.双歧杆菌与嗜酸乳杆菌混合培养时微生态关
系研究[J].安徽农业技术师范学院学报,1999,13
(2):
5~10.
[17]张晓阳,卢忆,马艳莉,等.丁酸梭菌生理功能及应用研究进展[J].中国
食物与营养,2012,12:
31~35.
[18]CaoGT,XiaoYP,YangCM,etal.EffectsofClostridiumbutyricumon
GrowthPerformance,NitrogenMetabolismIntestinalMorphologyandCecal
MicroflorainBroilerChickens[J].JAnimVetAdv,2012,11(15):
2665~2671.
[19]GaoQX,QiLL,WuTX,etal.AbilityofClostridiumbutyricumto
inhibitEscherichiacoli-inducedapoptosisinchickenembryointestinalcells[J].
VetMicrobiol,2012,160(3~4):
395~402.
[20]KongQ,HeGQ,JiaJL,etal.
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- 丁酸 鼠李糖乳 杆菌 体外 混合 培养 肠道 致病菌 影响