Chapter6 基因组学与分子生物学实验技术.docx
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Chapter6基因组学与分子生物学实验技术
Chapter6基因组学与分子生物学实验技术
6.1基因组学
6.2分子生物学实验技术
6.1基因组学
1、产生背景及概念
Ø背景:
1985年提出HGP,随着HGP的提出和实施,产生了基因组学。
Ø概念:
以分子生物学技术、计算机技术和信息网络技术为研究手段,以生物体内全部基因为研究对象,在全基因背景下和整体水平上探索生命活动的内在规律及其内外环境影响机制的科学。
2、基因组学分类
Ø根据研究对象分:
肿瘤基因组学、植物基因组学、药物基因组学、环境基因组学等。
Ø根据研究的重点分:
结构基因组学、功能基因组学
3、结构基因组学
Ø概念和目的
以全基因组测序为目标的基因结构研究,弄清基因组中全部基因的位置和结构,为基因功能的研究奠定基础。
其目的是建立高分辨的遗传图谱、物理图谱、转录图谱和序列图谱。
Ø遗传图谱(连锁图谱):
指基因或DNA标志在染色体上的相对位置与遗传距离。
CM表示(基因或DAN片段在染色体交换过程中分离的频率)。
通过该图谱可分清各基因或DNA片段之间的相对距离与方向,如靠近着丝粒或端粒。
Ø物理图谱:
指DNA序列上两点间的实际距离。
用于确定各遗传标志间的物理距离有两种物理图谱:
(1)以已定位的DNA序列标记位点(STS)为位标,以DNA实际长度为图谱距离的基因组图谱。
(2)由YAC和/或细菌人工染色体(BAC)连续克隆重叠群组成的物理图谱。
Ø转录图谱(表达图谱):
以EST(表达序列标签肽)为位标,根据转录顺序的位置和距离绘制的图谱,它是染色体DNA某一区域内所有可转录序列的分布图,是基因图的雏形。
技术:
用已在染色体定位的YACDNA或BACDNA为探针,与所有可能相关的各组织cDNA文库杂交,寻找其同源克隆并做进一步分析。
Ø序列图谱(分子水平的物理图谱):
以某一染色体上所含的全部碱基顺序绘制的图谱。
既包括可转录序列,也包括非转录序列,是转录序列、调节序列和功能未知序列的总和。
4、功能基因组学与蛋白质组
Ø功能基因组学概念:
利用结构基因组学提供的信息,以高通量,大规模实验方法及统计与计算机分析为特征,全面系统地分析全部基因的功能。
研究角度包括:
生物学功能、细胞学功能、发育学功能等。
Ø蛋白质组概念:
某一物种基因组所能表达的全部蛋白质的组合即
5、反向遗传学:
在已知基因序列的基础上研究基因的生物学规律,通过功能丧失突变体研究其表型效应。
通过同源重组,用突变的基因取代野生型基因,导致功能丧失突变体,进行反向遗传学研究。
传统遗传学(正向遗传学)主要研究自发或诱发突变体中某一性状的遗传行为,如控制突变性状的基因数目及其在染色体上的位置、突变性状在后代中的传递规律等。
反向遗传学筛选到的突变体有时无突变表型效应的原因:
突变表型效应需在特定环境中才表现;基因家族中其他基因功能的代偿。
6、现代基因组学的发展需要依赖于分子生物学技术的应用!
ØDNA序列分析、DNA芯片技术
ØcDNA药物基因组学克隆
ØDNA序列的体外扩增与检测
Ø转基因基因技术、基因异体表达、基因敲除、基因沉默技术等
eg:
RNAi、micRNA、PNA技术、Ribozyme……
6.2分子生物学实验技术
所有生命科学实验都是基于差异。
在遗传学上我们必须找到突变体,才能够知道一个基因到底有什么作用,到底多么重要;在各种生化实验上,我们必须设置对照,看看目标根对照有什么差别。
6.2.1DNA凝胶电泳
1、基本原理:
一种分子在一定的电场中由于其本身所带电荷性质与电量的不同迁移的方向与速率也各不一样,据此可将不同的分子在电场中区分开来。
DNA分子带负电荷,在电场中迁移速率通常与其荷质比成正比,分子量越大,迁移率越小;相同分子量的DNA中构象压缩越紧密的迁移率越大(如ccc型DNA比L型和oc型质粒迁移率大)
2、琼脂糖(agrose)凝胶电泳
琼脂糖浓度:
一般0.7%的agrose即可,但是如果有特殊需要(如所分离检测的DNA片段太大或太小,则浓度可作调整)
电泳电压:
60—100V
指示剂(上样缓冲液):
含有溴酚兰,指示DNA迁移位置
Ø基本流程:
▪制胶:
称取适量的agrose,加入电泳缓冲液(TAE/TBE),加热至熔化备用
▪倒胶:
将胶槽洗净后晾干,摆好梳子,agrose冷却至65℃时倒入胶槽,注意不要产生气泡,胶槽放置应水平。
▪上样:
待凝胶冷却凝固后,拔取梳子,放入电泳槽,加入电泳缓冲液,并用移液枪赶走点样孔中的气泡,以移液枪将混有上样缓冲液的DNA样品注入点样孔,注意不要刺穿凝胶,同时点上ladder(或Marker,标准DNA)作为参照。
▪电泳:
60—100V电泳40min左右(根据溴酚兰的迁移位置终止电泳)
▪显色观察:
将凝胶放入含有EB(溴化乙锭)(0.5g/ml左右)的工作液中显色5min,在紫外线下观察电泳结果
3、脉冲电场凝胶电泳(pulsed-fieldgelelectropheresis,PFGE)
由于电泳槽大小有限,对于分子量大、迁移率小的DNA分子的分离效率较低,如何实现这种DNA的分离?
——减小agrose的浓度
——增加样品的迁移距离(PFGE)
Ø基本原理:
通过改变电场的方向,实现样品的迁移路径的改变,以此增加样品的迁移距离。
4、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)
Ø聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺混合交联形成
Ø根据丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺比例的不同,其交联程度也各不一样
Ø最小可将1个碱基差异的DNA片段区分出来(DNA测序的基础)
6.2.2DNA的变性与杂交
1、DNA的变性与复性
ØdsDNA的稳定因素疏水作用力/氢键/阳离子浓度等
ØdsDNA的变性(denaturation)双链DNA在变性剂或物理因素的作用下解链产生单链的过程。
⏹Tm值:
双链DNA变性中点时的温度。
(midpointofthetemperaturerangeoverwhichDNAisdenatured)
Tm值受到下列因素的影响:
▪G+C%,G+C%越大,Tm值越大(相同长度的dsDNA)。
▪G/C分布,G/C分布越均匀,Tm值越大;G/C分布不均匀时,A/T-rich区域容易形成变形中心,出现增色效应的跳跃现象。
▪盐浓度,阳离子能有效屏蔽dsDNA内部的静电斥力。
▪如果DNA片断﹤100bp,长度越长,Tm值越大。
⏹增色效应:
dsDNA变性形成ssDNA后,其紫外吸收值增加。
⏹变性因素:
变性剂/温度/pH等
ØDNA的复性(renaturation)
⏹复性也称为退火(anneal),是单链DNA相互配对形成双链的过程。
来源不同的两条单链核酸分子通过碱基互补形成异源双螺旋分子,称为核酸分子杂交。
这一过程决定于单链DNA分子的随机碰撞,符合二级反应动力学方程
⏹影响复性速率因素
•阳离子浓度:
0.18~0.2MNa+可消除polydNt间的静电斥力
•复性反应的温度:
增加分子的扩散运动
——通常是Tm-25℃(60-65℃),以消除S.S.DNA分子内的部分二级结构
•S.S.DNA分子的长度和DNA的动力学复杂性(kineticcomplexity,KC)
动力学复杂性:
指DNA片段中最小的非重复序列长度,一般来说可把原核生物的染色体长度看作其KC。
eg:
ATATATAT/AAAAAAA/ATCGATCGATCG的KC分别为2、1、4
•DNA的初始浓度C0:
C0越大,复性越快,分子容易发生随即碰撞
⏹C0t曲线
V=dCt/dt=-KCt2
V:
复性速率,即一定时间内单链DNA减少的速率dCt/dt
Ct:
即该时刻单链DNA的浓度
K:
复性常数
若t0为初始时间,C0为初始浓度,对上式积分有:
Ct/C0=1/(1+KC0t),据此可作出C0t曲线
当Ct/C0=1/2时K=1/Cot(1/2)
Cot(1/2)可说明单链DNA复性常数K的大小,而在相同反应体系下各影响复性的因素(初始浓度、离子浓度、温度)都是一致的,复性常数K的大小与单链DNA的KC(动力学复杂程度)成反比!
因此:
E.coliCot(1/2)/XCot(1/2)=E.coliKC/XKC
由Cot(1/2)的比较可以推测未知DNA的长度
2、核酸的分子杂交(MolecularHybridization)
Ø核酸分子杂交的概念:
用标记的已知DNA或RNA片段(探针)来检测样品中未知核酸序列,通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合,再经显影或显色的方法,将结合核酸序列的位置或大小显示出来。
待测的核酸序列,可以是克隆的基因片段,也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的RNA。
Ø应用:
可通过特定序列的探针检测样品中是否含有与之同源的核酸序列。
基因克隆的筛选
酶切图谱制作
基因组中特定基因序列的定量和定性检测
基因突变分析
疾病的诊断、微生物病原体检测
Ø特点
⏹灵敏度高(<1pg互补序列)
⏹速度快(<24h)
⏹简单易行
Ø分子杂交的类别:
▪根据杂交对象的不同可分为:
DNA与DNA(Southernblot)
RNA与DNA(Northernblot)
另外:
Westernblot
Southernblot(Southern印迹)和Northernblot(Northern印迹)技术实际上是分子杂交、DNA凝胶电泳等技术的综合。
▪根据杂交对象位置的不同可分为:
固相杂交
液相杂交:
核酸酶S1保护分析法;RNA酶保护分析法
原位杂交(insituHybridization)
Ø影响核酸分子杂交的因素:
♦探针浓度、长度、复杂性:
探针浓度越高,复性速度越快。
但双链探针浓度过高会增加自我复性而影响杂交;浓度过高也会增加非特异结合,使杂交背景增强。
探针越长扩散速度越慢;复杂性越高,配对难度也增大。
♦离子强度:
高离子强度溶液中,正离子可中和DNA链磷酸基团的负电荷,削除相互间的静电斥力,有利于杂交分子形成。
♦温度:
通常在低于Tm20-25℃的温度下进行杂交。
♦添加剂:
硫酸葡聚糖、聚乙二醇、聚丙烯酸等,因其表面可吸附DNA探针,使DNA接触面增大,而加速杂交反应。
⏹杂交条件的严谨性:
指杂交反应体系中,避免非同源性或部分同源性的核酸序列形成杂交复合物的严格程度。
它主要与杂交反应的温度、离子强度和洗膜的温度有关。
实际操作时,一般采用较低严谨性杂交以提高反应速率,以较高严谨性洗膜以尽量洗去非特异性结合和配对较差的探针,以提高特异性。
Ø基本流程(以southernblot为例):
▪分离样品(提取DNA)
▪对样品进行凝胶电泳
▪DNA转膜、固定:
电转移/虹吸转移/真空转移
▪制备标记探针(同位素标记、荧光标记等)
核酸探针是指能与特定核酸序列发生特异性互补的已知核酸片段。
一般而言,核酸探针带有特殊的标记物。
1)探针的类别:
cDNA探针/RNA探针/寡核苷酸探针/PCR扩增产物等
2)探针所携带的标记物应具备的条件:
标记后的探针的分子结构要尽可能与原来的分子结构相同,绝不影响其碱基配对特异性,不影响探针分子的主要理化特性,尤其是杂交特性。
标记探针的检测方法简便、省时、准确可靠、重复性好、灵敏度高。
稳定性好、环境污染少、价廉。
3)标记的类型:
同位素标记——3H、32P、35S、125I等。
非放射性同位素——地高辛素、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等。
4)常用的探针标记法:
切口移位(平移)法——Klenow酶等
•引物延伸法——Klenow酶等
•末端标记法——末端脱氧核苷酸转移酶;T4-PNP、CIAP;Klenow酶等
•体外转录法——获得RNA探针
▪经预杂交后用探针与尼龙膜上的单链DNA相互杂交
为了减少探针与广泛存在的非互补核酸或支持介质(尼龙膜等)的非特异性结合,在杂交前可用封闭物将这些非特异位点封闭。
在杂前的这些处理过程称为预杂交。
常用于预杂交的封闭物:
——变性的非特异性DNA:
常用鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA。
当与滤膜一起孵育后,除滤膜上已吸附样品DNA的区域外,它们可被吸附到所有其它区域,使整个背景覆盖一层。
由于它们与探针无同源性,在交杂反应中可大大减少探针的非特异性结合,使背影清晰。
——高分子化合物:
某些高分子化合物具有封闭膜上非特异位点的能力。
一般常用Denhard`t溶液,包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖。
▪洗膜,去除非特异性杂交
▪显影(如果是同位素,需要自显影,如果是荧光标记,可直接观察)
6.2.3DNA序列分析——DNAsequencing
序列分析的两个基本技术:
ØPAGE:
其分辨率能达到1bp,制胶的要求严格(容易发生误差)
Ø复制产物的标记:
底物(dNTP同位素标记)或引物标记
1、Maxam-Gilbert化学修饰法
——1977年Maxam和Gilbert[美]首次应用此法测定SV40的基因组(5226),是唯一能直接应用于双链DNA测序的方法。
1)基本原理
将末端标记的DNA用专一性化学试剂在A,T,G,C处进行部分降解,由此得到含有各种长度的具放射性末端标记的四组片断(定点随机中断的DNA片断);用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同长度的片断;从它的放射自显影图谱上可直接读出DNA的序列。
2)四个反应体系
⏹G系统:
pH8.0硫酸二甲酯→G→m7G→C8~N9断裂→脱G
⏹A+G系统:
pH2.0哌啶甲酸(pidine)→嘌呤环N质子化→脱嘌呤
⏹C系统:
1.5mol/LNaClC+肼(hydrazine)→脱C
⏹T+C系统:
肼(hydrazine)→打开嘧啶环→重新5C环化→脱嘧啶
3)基本流程
⏹待测序DNA单链的末端标记
⏹分别用四个系统处理得到定点随机打断的DNA片断
⏹电泳将这些随机打断的片断分离(按片断长短依次在凝胶中排列开来)
⏹读取数据
2、Sanger双脱氧终止法
1)基本原理:
以待测序的DNA作为模板,在DNApol的作用下可进行DNA复制,如果在反应体系中添加双脱氧底物,则DNA复制可能发生定点随机终止,即在确定的位点(双脱氧底物与模板配对的位置)随机(在这些位置可能因正常底物的竞争而顺利复制)终止复制,对这些复制的产物进行电泳可根据片断大小与末端的碱基依次排列最终得到模板DNA的序列。
2)基本流程:
Ø双脱氧底物造成复制时的定点随机中断反应
Ø电泳(将定点随机中断的复制产物按片断长短依次在凝胶中排列开来)
Ø读取数据
思考:
对一段ssDNA进行序列分析(双脱氧末端终止法),电泳并自显影,得到图a的图谱(从左向右依次使用的双脱氧底物为ddGTP、ddATP、ddTTP、ddCTP),则该ssDNA的序列为。
A、5’------CTGA------3’
B、5’------AGTC------3’
C、5’------GTCA------3’
D、5’------TCAG------3’
3、DNA杂交测序法(Squencingbyhyheridization,SBH)
1)基本原理:
基于数学上的推测——对于一个确定长度(如12nt)的单链
DNA,它与一组随机排列的八核苷酸探针(88)完全杂交的可能组合是
12+1-8=5,根据杂交的情况可推测其序列。
是一种基于DNA-chip的测
序技术。
——问题在于如何确保这种杂交的准确性!
2)DNA芯片——DNAchip/micro-array
美国“Fortune”杂志预测:
2005年仅在美国用于基因组研究的芯片销售额可达到50亿美元。
2010年此项销售额将达到400亿美元。
鉴于DNA芯片技术领域的飞速发展,美国科学促进会将DNA芯片评为1998年的十大科技突破之一,认为生物芯片技术将是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命。
1998年6月29日美国宣布正式启动基因芯片计划。
⏹什么是DNA芯片?
基因芯片是将大量靶基因(或DNA片段)有序地、高密度地点在玻璃片或硅片或塑料片上等载体上所形成的矩阵。
将待侧样品用荧光染料标记制备成探针与芯片杂交,杂交信号用激光扫描仪检测,计算机分析检测结果,可获得类似与传统的点杂交的杂交数据,以达到快速、高效、高通量及平行性的分析生物信息的目的。
——实际上DNA芯片就是以杂交为基础,应用现代高科技将包含特定信息(特定序列)的DNA集成到一块小的支持介质上,这些固定的DNA能与标记的样品特异性结合,通过一定的手段进行信号检测,这样就可以在这一介质上实现常规杂交检测的目的。
——目前技术:
1.6cm2;40万个点;20个核苷酸;
⏹基因芯片技术流程:
•芯片制备——目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体,采用原位合成和微矩阵的方法将寡核苷酸片段或cDNA作为探针按顺序排列在载体上。
芯片的制备除了用到微加工工艺外,还需要使用机器人技术。
以便能快速、准确地将探针放置到芯片上的指定位置。
•样品制备——生物样品往往是复杂的生物分子混合体,除少数特殊样品外,一般不能直接与芯片反应,有时样品的量很小。
所以,必须将样品进行提取、扩增,获取其中的蛋白质或DNA、RNA,然后用荧光标记,以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。
•杂交反应——杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程。
选择合适的反应条件能使生物分子间反应处于最佳状况中,减少生物分子之间的错配率。
•信号检测和结果分析——杂交反应后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件可以分析图像,将荧光转换成数据,即可以获得有关生物信息。
⏹DNA芯片的用途:
只要是杂交能做到的,DNA芯片就能做到,而DNA杂交做不到的,DNA芯片也能做到
⏹应用举例:
表达谱芯片在疾病研究中的应用
应用表达谱芯片检测人正常肝细胞与肝癌细胞中差别表达的基因
?
将4096条人cDNA制备成表达芯片。
(1500条为已知基因,2548未知,16个阴性对照基因,32个空白点。
)
?
提取人正常肝和肝癌组织mRNA.
?
逆转录成cDNA。
?
将Cy3和Cy5荧光分别标记到两条cDNA。
?
与芯片杂交、扫描。
?
计算机数据处理,判断差别表达的基因。
结果:
筛选出差别表达的基因共有903条。
6.2.4聚合酶链式反应——(PolymeraseChainReaction,PCR)
1)PCR基本原理
在模板、引物、4种dNTP和赖热DNA聚合酶存在的条件下,特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。
2)历史回顾:
KariB.Mullis1985年提出体外实现DNA复制的设想
1988年通过热稳定性DNApol实现这一设想
1993年,诺贝尔化学奖
3)基本步骤:
⏹变性:
加热使双链DNA变为单链
⏹退火:
降温使引物和互补模板在局部形成杂交链
⏹延伸:
耐热DNA聚合酶按5’→3’方向催化以引物为起始点的延伸反应
⏹以以上三步为单元循环进行DNA扩增
4)相关的组分:
♦模板:
对其纯度要求不高,但要求去除干净核酸酶、蛋白酶及有机溶剂
♦引物:
根椐待扩增的DNA片段,设计其特异的上、下游引物。
♦耐热DNA聚合酶:
TaqDNA聚合酶,无校正功能(0.1%~0.25%),扩增片断不宜过长,一般﹤3Kb。
此外TaqDNA聚合酶具有类似未端转移酶的功能,能催化dNTP加到DNA的3’-OH端(其中对dATP的亲和力较大),因此PCR产物的末端总是带有两个A。
♦10×PCR缓冲液:
500mmol/LKCl——KCl能促进引物与模板的退火
100mmol/LTris-HCl(pH8.4,20℃)——维持碱性条件
150mmol/LMgCl2——活化TaqDNA聚合酶
加入适量二甲基亚砜或甲酰胺有利于破坏模板的二级结构。
♦2mmol/LdNTP贮备液:
含dATP、dCTP、dGTP、dTTP4种脱氧核苷酸。
5)PCR反应体系:
(示例)
10×PCRbuffer10μl
dNTPmix各200μmol/L
引物11μmol/L
引物21μmol/L
DNA模板50ng-1μg
Taq酶2U
加双蒸水至总体积为100μl
6)PCR扩增条件
94℃预变性300S后进入扩增循环→94℃变性60S→55℃复性→72℃扩增→→→→
(PCR扩增循环)
注意:
复性温度和扩增一般应考虑引物的构成;
扩增时间应考虑扩增片断的长度:
1kb,1min;3~4kb,3~4min
7)PCR产物的积累规律
反应初期,目的DNA片段呈指数扩增。
随着目的DNA产物逐渐积累,在引物一模板与DNA聚合酶达到一定比例时,酶的催化反应趋于饱和,此时扩增DNA片段的增加减慢进入相对稳定状态,即出现“停滞效应”,又称“平台期”。
到达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数,PCR扩增效率以及DNA聚合酶种类和活性,以及非特异产物的竞争等因素。
到达平台期前,TaqDNA聚合酶一般要进行25次以上PCR循环。
8)PCR引物设计(有专门的引物设计软件)
⏹PCR反应成功扩增的一个关键条件在于引物的正确设计。
引物设计的总原则就是提高扩增的效率和特异性。
其效率和特异性取决于两个方面,一是引物与模板的特异结合,二是聚合酶对引物的有效延伸。
⏹PCR反应中有两条引物,即5′引物和3′引物。
设计引物时,通常以信息链为基准,5′引物与位于待扩增片段5′上游的一小段DNA序列相同,以信息链的互补链为模板,引导信息链的合成,3′引物与扩增片段3′端的一小段DNA序列互补,引导互补链的合成。
PCR反应扩增的就是这一对引物之间的DNA片段。
⏹引物设计的原则:
♦引物长度一般为15~30个核苷酸。
引物过短会使PCR的特异性降低,过长会提高相应的退火温度,并使延伸温度超过TaqDNA聚合酶的最适温度74℃,亦会影响产物的生成,且合成引物的成本增加。
♦引物中的碱基尽可能随机分布,避免出现嘌呤,嘧啶的堆积现象。
尤其是引物的3’端不应有连续3个G和C。
否则会使引物在模板的G+C富集序列区错误配对。
引物中G+C的含量在45~55%左右。
设计引物时要考虑使3’端和5’端引物具有相似的Tm值。
引物长度要确保解链温度不低于54°C
♦引物自身内部不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。
按经验,引物自身存在的连续互补序列,一般不超过3bp。
♦两个引物之间不应存在互补序列,尤其应避免3’端的互补重叠。
♦引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。
尤其是引物3’末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列,否则易导致非特异性扩增。
♦引物3’端碱基是引发延伸的起点,因此一定要与模板DNA严格配对。
引物3’端的最佳碱基选择是G和C。
因为它们形成的碱基配对比较稳定。
♦引物的5’端可以修饰,如附加限制酶位点,引入突变位点,用生物素,荧光物质,地高辛标记,加入其它短序列包括起始密码子,终止密码子等。
在PCR的起始反应中,引物5’端游离的碱基并不影响引导新生链DNA合成的能力。
但在后续的扩增循环中,这些与初始模板不配对的序列被带到PCR
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- Chapter6 基因组学与分子生物学实验技术 基因组 分子生物学 实验 技术