单细胞RNA测序揭示治疗诱导的人类肺癌进化.docx
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单细胞RNA测序揭示治疗诱导的人类肺癌进化
单细胞RNA测序揭示治疗诱导的人类肺癌进化
导读
肺癌是导致癌症患者死亡的主要原因,它表现出的异质性使其具有适应性,限制了治疗的成功,且仍没有被完全了解。
本研究采用30名转移性肺癌患者在靶向治疗前和治疗期间的49份临床活检进行单细胞RNA测序(scRNA-seq)。
20000多个肿瘤微环境(TME)单细胞图谱显示了一个丰富而动态的肿瘤生态系统。
肿瘤细胞scRNA-seq检测的靶癌基因超出了临床检测到的。
作为残留疾病(RD)治疗后存活的癌细胞表达肺泡再生细胞信号,提示治疗诱导了细胞状态的原始转变,而在治疗引发的进展性疾病(PD)中出现的细胞则上调了犬尿氨酸、血纤维蛋白溶酶原和间隙连接通路。
RD表现为T淋巴细胞活跃和巨噬细胞减少,PD表现为免疫抑制的细胞状态。
scRNA-seq揭示的生物学特征是临床结果的生物标记,强调了治疗是如何诱导转移性癌的多细胞生态系统而形成临床结果。
实验设计
结果
1 靶向治疗晚期NSCLC的scRNA-seq分析
研究使用scRNA-seq测定49个样本(45个肺腺癌,鳞状细胞癌1例,癌旁组织3例[TATs])(图1A),对应30个患者。
使用特定工作流程从小的组织样本和手术切除部位中分离出可行的单细胞(图1B)。
样本被分为三个独立的时间点(TN,RD或PD),并根据致癌驱动因素进一步细分(图1C)。
图S1A中举例说明RD样本的采集时间。
表S1中包含了更多的样本细节和患者人口统计信息。
经质控筛选后共保留23261个细胞的基因表达谱。
基因表达归一化之后,进行了主成分分析(PCA),并在PCA空间上基于图形的聚类对细胞进行聚类分析(n=20)。
由此产生的细胞簇被标记为免疫细胞、基质细胞(成纤维细胞、内皮细胞和黑素细胞)或上皮细胞(图1D)。
上皮细胞(n=5,581)被切除并重新聚集成26个离散的上皮细胞簇(图S1B)。
每种类型的细胞数和每个样品用于分析的详细情况见表S1。
图1 患者特点及实验概述。
2基于聚类的拷贝数变异解决非癌性上皮细胞的癌症
考虑到癌症和大量染色体改变之间的联系,研究利用RNA表达的拷贝数变异(CNV)将上皮细胞分为癌症和非癌症;与成纤维细胞和内皮细胞(对照)相比,癌细胞在整个基因组中表现出更大的相对表达强度变化(图S1C)。
此分析包括三份TAT样本,来源于这些样本的大部分细胞被归类为非癌性细胞(表S1)。
研究比较不同治疗时间点之间样本(TN,RD,PD)的平均CNV评分,结果一致。
非癌症上皮细胞簇(n=16)被进一步注释为细胞亚型(图S1D和S1E)。
正如其他人所指出的,研究发现癌细胞表达的独特基因数量比非癌细胞高(图S1F)。
唯一表达基因数量的差异不能用测序深度来解释(Pearson相关性系数为0.19)。
49个原始肿瘤活检样本中有44个发现了癌细胞,包括小部分来自于TAT样本的细胞(占TAT获得细胞总数的0.57%-1.8%)。
鉴于TAT细胞可能代表了正常细胞和癌细胞之间的一种中间细胞状态,它们出现频率低。
将所有癌细胞(n=3754)重新聚类,形成25个独特的簇(图S2A和S2B)。
研究计算了每一个聚类簇中非癌症和癌症上皮细胞群中贡献最大的单个患者的细胞数(患者占有率)(图S2C-S2E)。
大多数肿瘤细胞簇是源于患者,有很高的患者占有率,结果类似于之前的报告。
相反,非癌细胞类型表现出较低的患者占有率(图S2E)。
因此,针对特定患者的恶性细胞聚类反映了个别患者肿瘤的独特分子特征。
3 scRNA-seq分析揭示了癌细胞表达基因改变的复杂性
基因改变可以与主要的靶向性致癌“驱动”改变共存(如致癌基因EGFR、ALK、KRAS),也可能有助于促进肿瘤进展和限制治疗。
研究分析了每个癌细胞的scRNA-seq转录本以识别体细胞的变化(图2A-2C;图S2G-S2I)。
49个活检样本中有44个样本含有癌细胞,鉴定出20个样本含有临床已知的致癌驱动因子(图2B;表S3)。
所占百分比与scRNA-seq分析中可能出现的占有率一致。
在没有识别出临床上已知的致癌驱动基因的24个样本中,没有细胞表达这些基因,因此不允许对这些基因进行突变检测(图S2H;表S3)。
在20个样本的11个样本(55%)中确定了临床致癌基因,还确定了在同一患者肿瘤的临床级批量核酸检测中未检测到的另一种致癌基因改变(即隐匿性基因改变)(图2B;图S2H)。
LTS47就是一个例子。
经临床级DNA分析,该肿瘤中存在EML4-ALK致癌基因重排。
另外,scRNA-seq还显示,该样本含有KRASG13D和KRASG12C隐匿突变的癌细胞(图S2F)。
考虑到scRNA-seq数据中可能存在的遗漏,研究人员不能断定ALK融合和KRAS突变是否共存于同一细胞内。
然而,KRAS突变体细胞中没有显示ALK基因重排的迹象。
该样本是在经过多种治疗后从患者身上获得的,这可能会导致多种耐药机制的进化。
致癌驱动基因的缺失也是一种耐药机制,但考虑到scRNA-seq的局限性,我们不能确定这种耐药机制是否适用于本案例。
研究人员还查询了COSMIC(癌症体细胞突变目录)中肺腺癌第1级突变的突变数据(表S2)。
尽管发现的许多突变已经包括在临床小组中,但在对病人肿瘤进行的临床分析中并没有报道过(图2C;图S2I;表S2和S3)。
虽然这可能反映了临床检测时活检技术或肿瘤克隆性的差异,但这些结果也表明临床级批量DNA检测可能低估了肿瘤的异质性。
为了评估存在多种致癌改变的患者的临床结果,并确定本研究的研究结果更广泛的转化影响,使用了NSCLC数据库的MSC-Impact。
那些在scRNA-seq图谱中检测到的1级COSMIC集中有大于或等于2个突变的患者(高突变)与那些肿瘤中有小于2个COSMIC1级突变(低突变)的患者相比,其总体生存率(OS)显著降低(p<0.01;图S2J)。
因此,scRNA-seq分析可以增加对癌细胞基因组异质性的分析力度,并洞察转录突变的情况。
图2scRNA-seq可以推断患者的突变状态,并揭示癌细胞中复杂的突变情况。
4 TN和RD癌细胞的转录差异揭示了细胞状态特异性的生物学过程
研究假设,在治疗期间癌细胞中激活的生物过程可以识别在初始治疗期间(包括RD)促进癌细胞适应和生存的信号通路。
比较了从TN到RD的肿瘤样本中获得的单个癌细胞的转录本(表S4),并着重关注了RD癌细胞中629个上调的基因,可作为通路激活的替代证据,发现了许多与癌症相关途径相关的基因(表S5)。
重要的是,研究还发现,与TN和PD相比,RD癌细胞表达的增殖标记基因减少,这与预期一致,即在靶向治疗期间,持续存在的癌细胞通常增殖较少(图S3A)。
有趣的是,研究鉴定了一个由17个已建立的肺泡细胞基因标记组成的肺泡细胞基因表达特征,在RD和TN时间点上其表达显著增加(图3A;图S3B;表S2)。
肺泡细胞由肺泡1型(AT1)和肺泡2型(AT2)亚型组成,构成肺泡的内衬。
AT2细胞产生表面活性剂,可作为干细胞样祖细胞,在各种类型的肺损伤中变得活跃并增殖,被怀疑是癌基因驱动的肺癌的细胞来源。
AT1细胞是肺泡中的优势细胞群,介导气体交换,在受伤或死亡时,可释放增殖和再生信号。
AT1细胞包括HOPX+/IGFBP2+和HOPX+/IGFBP2-两种亚型,后者代表维持细胞可塑性的细胞群,可增殖并转化为AT2细胞,使损伤后组织再生。
在RD癌细胞中检测到的肺泡特征包括AT1和AT2相关基因(表S2),包括AT2细胞的AQP4、SFTPB/C/D、CLDN18、FOXA2、NKX2-1和PGC,AT1细胞的AGER、HOPX和IGFBP2(图S3B)。
此外,研究在癌细胞中鉴定的肺泡细胞状态并不是来自我们的癌细胞群中注释错误的非癌症肺泡细胞(图S3C)。
研究用正交方法验证RD时肺泡细胞特征的激活。
首先,使用由患者衍生的EGFR突变NSCLCs(PC9)组成的临床前模型开发TN、RD和PD临床状态的类似物。
通过RT-PCR,检测了RD临床样本中显著上调的肺泡细胞标志基因NKX2-1的表达,发现与对照和获得性耐药状态细胞相比,在维持状态细胞中NKX2-1的表达显著升高(图3B)。
这表明从临床scRNA-seq分析中识别的肺泡特征可以在体外受控条件下复制。
此外,免疫组化(IHC)分析显示,与TN和PD临床样本相比,RD临床样本的质膜上可诱导AQP4蛋白表达,AQP4是肺泡细胞特征的另一标志物(图3C;图S3D)。
在TCGA肺腺癌组织RNA-seq数据集中,测试肺泡特征是否为患者生存的临床相关生物标志物,发现,与肿瘤表现出较低表达的肺泡特征的患者相比,这些肿瘤的肺泡特征高表达与患者OS改善之间存在显著相关性(图3D;表S6)。
这些发现支持了RD癌细胞有明显的肺泡基因表达特征的论断,并与改善患者生存率相关。
一个可能的模型是,RD癌细胞激活的肺泡特征反映了细胞损伤和修复特征,使人联想到非癌症的AT1和AT2细胞。
这一特征的表达增加可导致治疗期间细胞死亡的修复和逃避,以支持癌细胞的持久性,同时构成一个较低的侵略性恶性状态。
这与RD代表了一种在临床前模型中观察到存活但不快速增殖的缓慢循环癌细胞的永久细胞状态的观点是一致的(如图S3A所示),它是绝对耐药性引发侵袭性肿瘤进展的前导。
肺泡的分子特征和细胞损伤修复的特征是值得关注的。
在本研究的RD中,WNT/β-catenin相关通路基因SUSD2和CAV1表达增加(表S5)。
研究使用IHC分析SUSD2和CTNNB1(β-catenin)蛋白表达(图S3E和S3F)来验证观察到的转录变化。
与本研究的scRNA-seq结果一致,与TN和PD相比,RD状态中膜SUSD2和核CTNNB1(β-catenin)显著增加。
此外,在两个临床试验(奥希替尼:
NCT03433469或克唑替尼:
NCT03088930)中,从EGFR(AZ)或ROS1(NC)接受新辅助TKI治疗的患者中获得的成对TN和RD样本中,CTNNB1核定位的比较如图S3G所示。
SUSD2是WNT通路激活的下游靶点,而CAV1可促进β-catenin(CTNNB1)的核定位和WNT/β-catenin通路的转录激活。
在NSCLCs中,WNT/β-catenin信号通路有助于细胞损伤后的肿瘤发生、修复和再生。
AT2细胞的自我更新和损伤反应特异性依赖于WNT/β-catenin信号通路。
此外,在EGFR突变的NSCLC中,WNT/β-catenin通路的激活可能限制EGFR抑制剂的反应,并可能在体外EGFR抑制剂治疗期间促进永久细胞群的存活。
总的来说,RD状态以细胞损伤和存活信号为特征,这些信号部分通过WNT/β-catenin通路发挥作用,可能具有治疗靶向性。
临床数据表明,在原发性EGFR或ALK靶向治疗中,WNT/β-catenin激活在治疗早期参与促进RD和耐药细胞的发展。
为了进一步探索WNT通路研究结果的治疗潜力,研究使用患者来源的PC9细胞作为EGFR突变的NSCLC模型,使用H3122细胞作为ALK融合驱动的NSCLC模型。
研究测试了这一假设,即预先阻断WNT/β-catenin信号通路以及致癌EGFR或ALK,这将减少在初始治疗中存活的细胞数量,并在治疗开始时增加反应强度。
亲代细胞分别用EGFR或ALKTKI(奥希替尼或艾乐替尼)的IC50(导致细胞数量减少50%的抑制剂浓度)剂量处理。
两种不同的WNT/β-catenin通路抑制剂XAV939和PRI-724用四种先前报道的浓度或联合治疗进行测试。
体外实验结果支持了本研究的假设,证明前期抑制WNT/β-catenin通路与同源TKI结合导致明显的细胞融合且剂量依赖下降和反应强度增加(图3G-3J;图S3H-S3O)。
5 通过s
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