分子生物学实验指导讲义.docx
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分子生物学实验指导讲义
分子生物学实验B
实验指导
实验一 植物总DNA和RNA的提取与鉴定
(一) 植物总DNA的提取
一、目的与要求
1、学习和掌握CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。
2、掌握紫外光吸收法鉴定DNA纯度和浓度的方法。
二、实验原理
CTAB法是一种提取植物总DNA的常用技术。
CTAB是十六烷基三甲基溴化铵的缩写,是一种非离子型去污剂。
植物叶片经液氮研磨导致细胞壁破裂后,加入去污剂CTAB,可使核糖核蛋白体解析,然后使蛋白和多糖杂质沉淀,DNA进入水相,再用酚、氯仿抽提纯化DNA。
CTAB与核酸形成的复合物在高盐(>0.7mmol/lNaCl)浓度下可溶;但在低盐浓度(0.1~0.5mmol/lNaCl)下沉淀,而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。
核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。
核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。
纯的DNA样品A260/280约1.8,且1μg/ml的DNA溶液A260约0.020。
三、基本步骤
1.称取0.2g新鲜的植物叶片,用蒸馏水冲洗叶面,吸水纸轻轻吸干水分;
2.将叶片剪成1cm长,置研钵中,倒入液氮,尽快研磨成粉末;
3.在液氮完成挥发之前,将粉末转入加有750μL预热(65℃)的CTAB提取缓冲液的2mL离心管中,65℃水浴保温30-60min,不时地轻轻摇动混匀,使其充分裂解;
4.取出,冷却到室温,加入等体积(750μL)的24:
1的氯仿/异戊醇,盖上盖子,温和摇动,使成乳状液,静置10min;
5.10000rpm离心10min;
6.取出离心管(出现3层),小心地吸取上层清液转移到干净的2mL离心管中(根据需要,上清液可用氯仿/异戊醇反复提取多次,去除杂质);
7.沿离心管壁慢慢加入2倍体积预冷的无水乙醇(或2/3体积的异丙醇),(注:
为使DNA沉淀完全,可将离心管放于-20℃冰箱中,静置30min以上)。
8.10000rpm离心10min,并室温干燥(或真空干燥)。
9. 用0.2ml70%乙醇洗涤沉淀 1次,室温下微干,加入70µl 高盐TE缓冲液和1µl的RNaseA,颠倒混匀,37℃保温0.5h。
10.将沉淀用70%乙醇清洗两次后,晾干,加入50µlTE或无菌水溶解沉淀。
11.加入2倍体积预冷的无水乙 醇,充分混匀,于4℃,7500g(对于小样品,在离心机上以10000r/min)离心15min。
12.测定该溶液在紫外光波260nm和280nm的吸光值计算提取DNA的浓度(也可同时进行琼脂糖电泳)。
五、实验材料与耗材
1、实验材料:
植物叶片(幼嫩叶片为佳)。
2、耗材:
2ml离心管×1,玻璃棒×1,陶瓷研钵和杵子×1,50ml烧杯×1,剪刀×1,滴管×1。
3、试剂:
液氮,CTAB,Tris碱,Na2EDTA,NaCl,β-巯基乙醇,盐酸,氯仿,异戊醇,乙醇
六、仪器与设备
冰箱,恒温水浴锅,高速冷冻离心机,紫外分光光度计
七、注意事项
1、液氮研磨时,小心操作,以免冻伤。
2、所有操作均需温和,避免剧烈震荡。
(二)植物总RNA的提取和含量测定
一、目的与要求
1、了解RNA的特性。
2、掌握Trizol法提取RNA的原理及操作技术。
二、实验原理
RNA分子是化学性质非常活跃的分子。
在提取细胞内RNA的过程中,RNA分子容易受细胞内核酸酶、化学试剂、机械震荡等多种因素影响而破坏分子结构,导致提取失败。
Trizol是一种新型总RNA抽提试剂,内含异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞,抑制细胞释放的核酸酶活性。
Trizol适用于从多种组织和细胞中快速分离总的RNA。
三、基本步骤
1、称取1g新鲜的植物叶片,用蒸馏水冲洗叶面,吸水纸吸干水分。
2、将叶片剪成1cm长,置预冷的陶瓷研钵中,倒入液氮,快速研磨成粉末。
3、待液氮蒸发完后,快速称取0.1g粉末移到1.5ml离心管中,加入1ml Trizol.试剂,充分振荡,冰上静置3~5min。
4、加入200μl氯仿/异戊醇(24:
1)或氯仿,剧烈振荡混匀30秒。
5、离心12000rpm,4℃,10min。
6、将上清液小心转移到新1.5ml离心管中,加入与上清等体积的异丙醇,-20℃,30分钟。
注:
不要吸取任何中间层物质,否则会出现DNA 污染。
7、离心12000rpm,4℃,5分钟。
8、小心移去上清液,防止沉淀丢失。
9、加入700μl70%酒精洗涤,离心12000rpm,4℃,5分钟。
10、重复步骤‘9’。
11、离心结束后,弃去上清,防止丢失RNA沉淀。
12、室温干燥,让乙醇挥发完全。
13、加入30~50μl的DEPC水溶解,可以-70℃保存。
注:
可以采用电泳技术或光谱技术检测RNA的浓度、纯度情况。
四、溶液配制
1、Trizol试剂:
直接使用供应商提供的Trizol类试剂;每组1ml。
2、氯仿-异戊醇混合液(24:
1,V/V):
分别量取96ml氯仿和4ml异戊醇混合均匀;每组200μl。
3、70%乙醇:
量取70ml无水乙醇用水定容到100ml,4℃保存;每组1.5ml。
4、0.1%DEPC超纯水:
用移液枪吸取1mlDEPC,加入1l待处理超纯水,经猛烈振摇后,于室温静止数小时,然后高压灭菌,以除去降解DEPC(DEPC分解为CO2和乙醇);每组用少量。
五、实验材料与耗材
1、实验材料:
植物叶片(幼嫩材料为佳)。
2、耗材:
1.5ml离心管(DEPC处理),移液器(规格1000μl、10μl),Tip头(DEPC处理)。
3、试剂:
Trizol试剂,氯仿,异戊醇,无水乙醇,超纯水,DEPC(二乙基焦碳酸酯),超纯水(DEPC处理)。
六、仪器与设备
冰箱,超净工作台,冷冻高速离心机,制冰机。
七、注意事项
全程佩戴一次性手套。
皮肤经常带有细菌和霉菌,可能污染抽提的RNA并成为RNA酶的来源。
实验项目二:
质粒DNA的提取
一、目的与要求
1、学习碱裂解法提取质粒的基本原理。
2、掌握碱裂解小量提取质粒的实验技术。
二、实验原理
质粒是细菌细胞内独立于染色体外的遗传物质,是环状的双链DNA分子。
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异而分离。
在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内,线性的DNA和共价闭合环状质粒DNA的氢键都会被断裂,双螺旋结构解开而变性。
当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时,共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链复性迅速而准确,重新溶解在液相中;而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开,不能迅速而准确地复性,它们缠绕形成网状结构。
通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA,蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
三、基本步骤
1、将含有目的质粒的E.coli菌株接种于LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜。
2、取1ml培养物倒入1.5ml管中,12000rpm/min,离心1min。
3、弃去培养液上清,使细胞沉淀尽可能干燥。
4、将细菌沉淀悬浮于100μl冰预冷的溶液Ⅰ中,剧烈振荡。
5、加200μl溶液Ⅱ(新鲜配制),盖紧管盖,快速颠倒5次,混匀内容物,将离心管放在冰上。
6、加入150μl溶液Ⅲ(冰上预冷),盖紧管盖,颠倒数次使混匀,冰上放置5min。
7、12000r/min,离心10min,将上清液转至新1.5ml离心管中。
8、向上清液加入等体积的饱和酚,混匀。
9、12000r/min,离心5min,将上清液转至新1.5mL离心管中。
10、向上清液加入2倍体积无水乙醇,混匀后,室温放置5~10min。
12000r/min离心5min。
倒去上清液,把离心管倒扣在吸水纸上,吸干液体。
11、1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀,振荡并离心,倒去上清液,真空抽干或空气中干燥。
12、20μlTE缓冲液,使DNA完全溶解,-20℃保存。
13、琼脂糖凝胶电泳检测提取的质粒DNA样品。
四、溶液配制
1、1.0mol/lTris(pH8.0):
称取12.11gTris用约80ml水溶解后,加入约4.2ml浓盐酸将溶液pH调到8.0,最后用100ml容量瓶定容;每组不到0.1ml。
2、0.5mol/lEDTA(pH8.0):
称取18.61g Na2EDTA用约80ml水溶解后,加入约2gNaOH,调节pH至8.0,最后用100ml容量瓶定容;每组不到0.1ml。
3、0.4mol/lNaOH:
称取0.8gNaOH固体溶解后定容到50ml。
4、2%SDS:
称取1gSDS固体溶解后定容到50ml。
5、5mol/l乙酸钾:
称取49g乙酸钾固体,溶解后定容到100ml。
6、溶液Ⅰ(pH8.0):
含有50mmol/l葡萄糖、5mmol/lTris、10mmol/l EDTA。
称取0.9g葡萄糖,用约50ml蒸馏水溶解后,分别量取0.5ml的1.0mol/lTris溶液和4ml的0.5mol/lEDTA溶液加入混匀,加水定容到100ml。
121℃湿热灭菌15min,4℃保存;每组100μl。
7、溶液Ⅱ:
将等体积的0.4mol/lNaOH和2%SDS混合,新鲜配制;每组200μl。
8、溶液Ⅲ:
含有5mol/l乙酸钾和3mol/l冰乙酸。
分别量取60ml的5mol/l乙酸钾和11.5ml冰乙酸,加水定容到100ml。
121℃湿热灭菌20min,4℃保存;每组150μl。
9、70%乙醇:
量取70ml无水乙醇用水定容到100ml;每组1ml。
10、TE缓冲液(pH8.0):
该溶液含有10mmol/lTris和1mmol/lEDTA。
分别量取1ml1.0mmol/lTris和0.2ml0.5mol/lEDTA,混合均匀后定容到100ml;每组50μl。
五、实验材料与耗材
1、实验材料:
含有目标质粒DNA的大肠杆菌细胞。
2、耗材:
1.5ml离心管×3,移液器(规格1000μl、100μl、10μl)。
3、试剂:
葡萄糖,Tris碱,盐酸,Na2EDTA,NaOH,SDS,乙酸钾,冰乙酸,乙醇,tip头(需要高压灭菌处理)。
六、仪器与设备
恒温摇床,台式离心机,高压灭菌锅,制冰机。
七、注意事项
1、实验中使用的溶液和tip头都需要高压灭菌处理。
2、由于溶液Ⅰ中含有葡萄糖,高压灭菌的时间过长,会导致葡萄糖碳化。
3、加入溶液Ⅱ后,要温和混匀。
4、溶液Ⅰ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE溶液都应4℃保存。
实验项目三:
PCR基因扩增
一、目的与要求
学习和掌握PCR反应的基本原理与实验技术。
二、实验原理
多聚酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)的原理类似于DNA的天然复制过程。
两个寡核苷酸引物分别结合在待扩增的目标DNA片段的两侧,经变性、退火和延伸若干个循环后,DNA扩增2n倍。
变性:
加热使模板DNA在高温下(94℃)变性,双链间的氢键断裂而形成两条单链,即变性阶段。
退火:
使溶液温度降至50~60℃,模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合,即退火阶段。
延伸:
溶液反应温度升至72℃,耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板,在引物的引导下,利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTP),按5′→3′方向复制出互补DNA,即引物的延伸阶段。
从理论上讲,每经过一个循环,样本中的DNA量增加一倍,新合成的链又可成为下一轮新循环的模板,经过25~30个循环后DNA可扩增106~109倍。
三、基本步骤
1、在PCR管内配制20μl反应体系:
反应物
体积(μl)
10×buffer
2.0
dNTP
0.5
引物1
1.0
引物2
1.0
rTaq酶
0.5
Template
1
ddH2O
14
总体积
20
2、按下列程序进行扩增:
① 95℃预变性 5min
② 95℃变性 1min
③ 55℃退火 1min
④ 72℃延伸 1min
⑤重复步骤②~④30次;
⑥ 72℃延伸 10min
3、琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果
配制0.7%琼脂糖凝胶,取10μl扩增产物电泳。
保持电流40mA。
电泳结束后,紫外灯下观察结果。
四、溶液配制
本实验中使用的10×缓冲液、dNTP、rTaq酶都直接由供应商提供,无需学生准备。
1、10×缓冲液:
含有500mmol/lKCl、100mmol/lTris·HCl(pH8.3)、15mmol/lMgCl2
和0.1%明胶。
2、dNTP:
分别含有1mmol/l的dATP、dCTP、dGTP、dTTP。
3、DNA模板:
模板DNA的浓度控制在1ng/μl。
4、引物1/2溶液:
配制的引物溶液浓度为10pmol/μl。
每组用量不到2μl。
五、实验材料与耗材
1、实验耗材:
冰盒,PCR管,移液器(规格20μl、10μl,2.5μl),模板DNA。
2、试剂:
10×聚合酶缓冲液,rTaq酶,dNTP,1对引物,超纯水,tip头。
六、仪器与设备
冰箱,PCR热循环仪,制冰机。
七、注意事项
1、实验中使用的tip头都需要灭菌处理。
2、PCR加样时,尽量保持低温操作,避免酶失活和模板、引物降解。
3、取样时注意不能污染试剂。
4、设置1份阴性对照,即用超纯水替代模板DNA进行PCR反应,以排除假阳性结果。
实验项目四:
琼脂糖凝胶电泳
一、目的与要求
1、学习和掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的实验技术和原理。
2、了解大分子染料染色检测核酸的实验技术。
二、实验原理
琼脂糖是从琼脂中分离制备的链状多糖,其结构单元是 D-半乳糖-3,6-L 半乳糖。
琼脂糖分子依靠氢键及其他作用力使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束,构成大网孔型凝胶。
该物质对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂有较强的抵抗力。
在pH4.0~9.0 的缓冲液中稳定。
由于其分子上无带电基团,在缓冲液离子强度大于0.05时,对蛋白质无吸附作用,也无电渗现象,因而分辨率和重现性均较好,是一种优良的电泳材料。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。
DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。
由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的静电荷,因此它们能以同样的速度向正极方向移动。
在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即DNA分子本身的大小和构型。
具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,可进行分离。
DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值呈反比关系。
凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA,也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子,如pUC19质粒有3种构型:
超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalentlyclosedcircularDNA,简称cccDNA);开环质粒DNA,即共价闭合环状质粒DNA的 1条链断裂(opencircularDNA,简称OCDNA);线状质粒DNA,即共价闭合环状质粒DNA的2条链发生断裂(linearDNA, 简称LDNA)。
这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移速度不同。
电泳后呈3条带,超螺旋质粒DNA泳动最快,其次为线状DNA,最慢的为开环质粒DNA。
传统的核酸染料溴化乙锭(EB)是一种高度灵敏的荧光染色剂,用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA。
溴化乙锭在302nm紫外光下激发并放射出橙红色信号。
由于溴化乙锭可以嵌入核酸分子的碱基中从而导致错配。
许多人认为溴化乙锭是强诱变剂,具有高致癌性。
为减少实验操作中有毒物质的接触,开发了多种安全性、稳定性和灵敏度都较好的大分子核酸染料,可以和核酸分子结合并在紫外灯下产生荧光,适用于各种核酸物质的检测。
三、基本步骤
1、制备琼脂糖凝胶
(1)按照被分离DNA的大小,决定凝胶中琼脂糖的百分含量。
可参照下表。
琼脂糖凝胶浓度(%)
线性DNA的有效分离范围(kb)
0.3
5~60
0.6
1~20
0.7
0.8~10
0.9
0.5~7
1.2
0.4~6
1.5
0.2~4
2.0
0.1~3
(2)称取0.3g琼脂糖,放入锥形瓶中,加入30ml0.5×TBE缓冲液,置微波炉或水浴加热至完全溶化,取出摇匀,则为1%琼脂糖凝胶液。
2、胶板的制备
①取有机玻璃内槽,洗净,晾干,用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好(一定封严,不能留缝隙)。
②有机玻璃内槽放置于一水平位置,并放好样品梳子。
③将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液,加入2μl大分子染料混匀后,缓缓倒入有机玻璃内槽,直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。
④待胶凝固后,取出梳子,取下橡皮膏,放在电泳槽内。
⑤加入电泳缓冲液至电泳槽中,让缓冲液盖过凝胶。
3、加样
用移液枪将上样缓冲液与DNA样品按1:
5比例混合,加入加样孔中(记录点样顺序及点样量)。
每次上样量约10μl。
4、电泳
①接通电泳槽与电泳仪的电源(注意正负极,DNA片段从负极向正极移动)。
DNA的迁移速度与电压成正比,最高电压不超过5V/cm。
②当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1~2cm处,停止电泳。
③将染色后的凝胶放入凝胶成像仪中拍照。
四、溶液配制
1、0.5mol/lEDTA(pH8.0):
称取18.61g Na2EDTA用约80ml水溶解后,加入约2gNaOH,调节pH至8.0,最后用100ml容量瓶定容。
2、5×TBE(贮存液):
分别称取54gTris和27.5g硼酸,用800ml蒸馏水溶解后,加入20ml0.5mol/lEDTA,定容到1000ml。
3、凝胶加样缓冲液(6×):
含有0.25%溴酚蓝和40%蔗糖。
分别称取0.25g溴酚蓝和40g蔗糖,用80ml蒸馏水溶解后定容到100ml;每个检测样品用量2μl。
五、实验材料与耗材
1、实验材料:
待检测的DNA。
2、耗材:
150ml三角瓶1个,50ml量筒1个,移液器(规格10μl)。
3、试剂:
琼脂糖,Tris碱,硼酸,溴酚蓝,蔗糖,大分子染料,DNAmarker,tip头。
六、仪器与设备
电泳仪,电泳槽,凝胶成像系统。
七、注意事项
1、上样时应将tip头伸入加样孔内加样,以免检测样品扩散到电泳缓冲液。
2、琼脂糖溶液中加入大分子染料时的温度不能太高,以免染料分子降解。
3、电泳时间不能过长,以免样品跑出凝胶。
4、取出琼脂糖凝胶观察时,要小心以免损坏凝胶。
5、接触含有大分子染料的凝胶需要带一次性手套,不能直接接触。
6、核酸染料分子也可以不在制胶的时候加入,而在电泳结束后将胶放入染料溶液中染色30min后再紫外检测。
实验项目五:
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
一、目的与要求
1、学习和掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的实验技术。
2、掌握热激转化实验技术。
二、实验原理
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
转化是指外源DNA导入细菌的过程。
其原理是细菌处于0℃,CaCl2低渗溶液中,菌体细胞膨胀成球形。
转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42℃短时间热激处理,促进细胞吸收DNA复合物。
将细菌放置在非选择性培养基中保温复苏一段时间,促使在转化过程中获得的新的表型(如Ampr等)得到表达,然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上,进行转化结果的筛选。
三、基本步骤
1、从大肠杆菌BL21平板上挑取一个单菌落接于2mlLB液体培养基的试管中,37℃振荡培养过夜。
2、取1ml菌液转接到一个含有50mlLB液体培养基锥形瓶中,37℃振荡培养2~3h。
(此时,OD600≤0.4~0.5,细胞数务必<108/ml,此为实验成功的关键)。
3、取菌液1ml加入1.5ml离心管,离心12000rpm,2min收集菌体细胞。
4、用1ml冰预冷的0.1mol/lCaCl2 溶液悬浮沉淀。
5、离心12000rpm,2min,回收细胞。
6、用冰预冷的0.1mol/lCaCl2溶液100μl 重悬沉淀。
此细胞为感受态细胞。
注:
在-4℃下可保存2周(2~4天,转化效率最高)。
7、取5μl的质粒加入100μl感受态细胞,冰上放置30min。
同时做两个对照管:
受体菌对照:
100μl 感受态细胞 +5μl 无菌水
质粒对照:
100μl0.1mol/lCaCl2溶液 +5μl 质粒DNA溶液
8、将离心管放到42℃循环水浴90sec。
9、迅速插入冰上,放置2~3min。
10、每个转化的离心管加入800μlLB液体培养基,37℃培养90min(慢摇)。
11、复苏培养后,离心12000rpm,2min,在超净台上用移液器弃去800μl上清(余下约100μl溶液),用移液器吹打混匀沉淀的细胞和余下的培养液。
12、将约100μl已转化的感受态细胞溶液,均匀涂布在含有氨苄青霉素的培养皿中。
13、倒置平皿37℃培养12-16h,第二天观察细菌生长情况。
四、溶液配制
1、0.1mol/l CaCl2:
称取1.11g CaCl2固体溶液,用80ml蒸馏水溶解后,定容至100ml,需要高压灭菌;每组2ml。
2、LB液体培养基:
分别称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10gNaCl固体,用800ml蒸馏水完全溶解后,用NaOH调节pH至7.0,加水至总体积为1l,121℃湿热灭菌20min。
3、LB固体培养基:
每1l液体LB培养基加15g琼脂。
4、100mg/ml氨苄青霉素(Amp):
称取Amp固体100mg,溶于1ml无菌水中。
有条件的情况下,可以将配制好的Amp溶液,用细菌过滤器除菌。
置-20℃冰箱保存。
五、实验材料与耗材
1、实验材料:
大肠杆菌菌株JM109细胞,待转化的重组DNA分子(含有Ampr)。
2、耗材:
培养皿,三角瓶,玻璃推子,移液器(规格1000μl、100μl、10μl),1.5ml离心管。
3、试剂:
CaCl2,胰蛋白胨,酵母提取物,NaCl,NaOH,氨苄青霉素
六、仪器与设备
超净工作台,冷冻高速离心机,恒温摇床,恒温培养箱,恒温水浴器,高压灭菌锅
七、注意事项
1、实验中使用的tip头、培养皿都需要高压灭菌。
2、熔化固体培养基后,加入Amp试剂时温度不宜过高,以免Amp失活。
3、超净台上无菌操作注意安全。
4、实验操作过程中尽量避免杂菌污染。
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