神经干细胞移植医治大鼠脊髓损伤的活体示踪研究.docx
- 文档编号:12216984
- 上传时间:2023-04-17
- 格式:DOCX
- 页数:7
- 大小:20.52KB
神经干细胞移植医治大鼠脊髓损伤的活体示踪研究.docx
《神经干细胞移植医治大鼠脊髓损伤的活体示踪研究.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《神经干细胞移植医治大鼠脊髓损伤的活体示踪研究.docx(7页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
神经干细胞移植医治大鼠脊髓损伤的活体示踪研究
神经干细胞移植医治大鼠脊髓损伤的活体示踪研究
作者:
张立峰,茅祖斌,蒋赞利
【摘要】目的:
探索利用MR技术活体追踪干细胞的可行性及神经干细胞(NSCs)移植对大鼠脊髓损伤(SCI)后功能恢复的影响。
方式:
66只SD大鼠随机分为假损伤组(A组)、SCI对照组(B组)和细胞移植医治组(C组)3组,应用已包被多聚左旋赖氨酸(PLL)的SPIO标记NSCs,对标记细胞进行普鲁士蓝染色,别离在细胞移植后第一、二、3、4、5周对各组动物进行BBB评分,细胞移植后一、3、5周行MRI检查。
结果:
(1)普鲁士蓝染色证明该方式标记NSCs的有效率为100%。
(2)细胞移植后1~5周,B、C组动物运动功能均有不同程度恢复,但B组恢复较慢,BBB评分不同有统计学意义(P<。
(3)TMRI检查见移植处在T2WI序列呈低信号改变,第3周时低信号向损伤区扩大,第5周时可在损伤区见到低信号改变。
结论:
MR技术可以活体追踪干细胞,NSCs移植医治SCI有利于大鼠后肢功能的恢复。
【关键词】脊髓损伤;神经干细胞移植;磁共振成像;大鼠
脊髓损伤(spinalcordinjury,SCI)后自身的修复能力超级有限,死亡的神经元不能由自身产生的神经元或临近的神经元来代替。
最近几年来神经干细胞(neuralstemcells,NSCs)的研究改变了这一观点。
NSCs是中枢神经系统中具有增殖和分化能力的一类细胞,是神经系统发育初期特定的细胞群体,它具有干细胞共有的特点,即能长久地维持增殖和分化能力[1]。
随着分子影像学的发展,干细胞移植后的体内活体追踪是近期研究的一个冲破点[2]。
本研究利用超顺磁性氧化铁(superparamagneticironoxide,SPIO)标记NSCs,对SCI大鼠进行细胞移植后的活体追踪,探索利用MR技术活体追踪干细胞的可行性和NSCs移植对SCI大鼠后肢功能恢复的影响。
1材料与方式
胎鼠来源NSCs的制备、培育与鉴定[3]
取胚龄14dSD大鼠胚胎的大脑脑室下区组织并吹打成单个细胞,以1×105ml-1种瓶,用DMEM/F12(1∶1)无血清培育基[内含bFGF20ng·ml-一、EGF20ng·ml-一、B2720ng·ml-1]培育。
每6~7d换液、传代1次。
对第2代细胞作免疫组化鉴定:
取无血清培育基贴壁分化培育24h的盖玻片1张,4%多聚甲醛固定30min。
%Triton-100破膜12min,然后用5%脱脂奶粉封锁特异性抗原,室温孵育30min,吸干残液滴加1∶500小鼠抗大鼠nestinIgG1(一抗),4℃孵育留宿。
第2天滴加FITC标记的羊抗小鼠IgG1二抗,室温孵育1h,然后50%缓冲甘油封气,荧光显微镜下观察并摄像。
NSCs的标记和染色
细胞传至第3代,取适量已包被多聚左旋赖氨酸(poly-L-lysine,PLL)的SPIO加入10mlDMEM/F12培育基中,37℃振荡60min,使SPIO终浓度为25μg·ml-1,将消化的细胞沉淀加入含SPIO的培育基中孵育12h完成标记。
NSCs标记后普鲁士蓝染色:
标记后的NSCs换成含10%血清的DMEM/F12培育液,置6孔板中培育7d,去掉培育液,PBS洗涤3遍,4%多聚甲醛固定30min,PBS洗涤3遍,含2%亚铁氰化钾的6%盐酸溶液常温孵育30min,显微镜下观察。
实验动物分组与SCI模型的制作
66只成年雄性SD大鼠,体重250~300g,随机分为假损伤组(A组,6只)、SCI对照组(B组,30只)及细胞移植医治组(C组,30只)3组。
B、C两组参照改良的Allen重物冲击法[4]制作大鼠脊髓背侧损伤模型:
实验前大鼠禁食8h,用戊巴比妥钠(30g·L-1)按40mg·kg-1腹腔注射麻醉,背部脱毛后俯卧位固定于动物手术台上,常规消毒,腰背部正中切口,逐层分开显露T8~T10椎板,行T9全椎板切除,显露硬脊膜,钳夹固定T8及T10棘突,用g的不锈钢棒(直径为mm)沿带有刻度的玻璃导管从25mm高处垂直下落,冲击在由塑料材料制成的底部呈凹面、直径为3mm的撞杆上,后者将冲击力传递给脊髓,造成大鼠脊髓不完全损伤,致伤后迅速移开冲击物,逐层缝合。
模型成功的判断标准:
冲击后损伤处脊髓出血、水肿,大鼠出现摆尾反射,双下肢及躯体回缩样扑动,麻醉清醒后双下肢呈弛缓性瘫痪。
A组仅行T9全椎板切除术作对照。
术后即刻腹腔注射5%葡萄糖盐水2ml,以补充血容量。
予青霉素钠盐5万U背外侧肌群肌肉注射预防感染,天天1次,持续3d。
注意保温,分笼饲养,自由取食,天天8:
00及20:
00行膀胱按摩协助排尿,直至成立反射性排尿。
细胞移植
将第3代悬浮培育的NSCs悬液用台式离心机离心5min(1000r·min-1),将细胞团以少量培育液吹匀,细胞计数为105μl-1。
C组动物SCI后9d于损伤节段下cm处用5μl微量注射器以与脊髓水平面呈30°角刺入脊髓组织中,注入2μlNSCs悬液,逐层缝合切口。
运动功能评分
BBB评分[5]为总分21分的运动功能评分,考察大鼠后肢的运动、躯干的位置和稳定性、步态、协调性、爪的置放、足趾间隙及尾的位置,表示SCI后大鼠后肢运动功能恢复的进程。
BBB评分简单直观,易于掌握,与脊髓功能恢复有极好的一致性。
别离在动物移植前第7天和移植后一、二、3、4、5周进行盲法BBB评分,由两名熟悉BBB评分标准的非实验人员观察。
将动物置于直径1m的平面滑腻场地自由活动5min,记录动物后肢运动情况。
MR检查
于术后第一、3、5周别离行MR检查,扫描序列为T2WI。
麻醉方式同前。
统计学处置
所有数据以x-±s表示,采用SPSS统计软件处置,组间比较采用t查验,P<表示不同有统计学意义。
2结果
NSCs的培育和鉴定情况
细胞培育NSCs在无血清培育基中进行体外培育,能维持其未分化的多潜能状态,换液后细胞生长迅速。
培育1周左右,随着NSCs的不断扩增,形成悬浮生长的神经球(neurosphere)(图1)。
图1培育7d时NSCs于无血清培育基中
形成的神经球×200
NSCs的鉴定NSCs是一类未成熟细胞,选择性地表达某些抗原标志,如巢蛋白(nestin,属中间丝蛋白)。
本实验巢蛋白免疫荧光检测结果示神经球有明显的荧光(图2,见封二)。
普鲁士蓝染色结果
显示100%的NSCs胞质内有细小的蓝色氧化铁颗粒(图3,见封二)。
运动功能评分
见表1。
所有动物在损伤术后1d双下肢全瘫(BBB评分为0),随后BBB评分有自发恢复,实验选用的大鼠在SCI后第9天BBB评分<7。
A组大鼠在各评分时间点均为21分。
细胞移植后1~5周,C组与B组动物运动功能均有不同程度恢复,但B组恢复较慢,BBB评分不同有统计学意义(P<。
表1不同时期各组BBB评分结果TMRI
将SPIO标记的NSCs移植到C组SCI下位1周后行TMR检查,见移植处在T2WI序列呈低信号改变,第3周时低信号向损伤区扩大,第5周时可在损伤区见到低信号改变(图4)。
图4NSC移殖后第5周在SCI部位有低信号改变
3讨论
SCI是一类中枢神经系统严重的致残性疾病,过去以为中枢神经组织不可再生,因此对SCI的医治显得束手无策。
但自1992年Reyonlds等[6]第一次报导体外成功分离神经干细胞至今,中枢神经系统不可再生的观念已完全被打破。
NSCs的出现为SCI的医治带来了希望。
在大量的SCI实验研究中,对NSCs的应用主要集中于单纯的NSCs移植、以NSCs为载体的转基因医治及NSCs联合生物材料的应用3个方面。
本实验就是对单纯的NSCs移植医治SCI进行进一步验证。
应用NSCs医治SCI的本质是实施细胞替代(cell-replacement),通过移植的NSCs大量增殖分化,替代损伤的脊髓组织,重建神经通路。
提高NSCs移植后存活率并定向调控其向神经元分化是现今研究的重点。
SCI后的脊髓内环境无益于NSCs的存活及分化。
实验发现SCI后产生大量的神经毒性物质,例如IL-一、IL-6和TNF-α,这些神经毒性物质致使了移植的NSCs死亡或分化成为胶质细胞,这些物质在损伤后24h内大量产生,24h后开始减少,选择适合的移植时间将会显著提高NSCs的存活率并增进其向神经元分化[7]。
Coumans等[8]也发现SCI后6周行胚胎脊髓移植能增进脊髓再生并使后肢功能取得明显改善。
Okano等[9]以为SCI后存在一个“窗口期”,在“窗口期”内进行NSCs移植医治SCI可能取得更好的效果,窗口期大约在SCI后的7~14d。
延迟移植明显提高了NSCs的存活率,必然程度上增进了NSCs向神经元分化。
可是时间太长损伤处形成瘢痕细胞又难以修复。
另外,Suzuki等[10]发现,NSCs球较单层培育的NSCs在SCI后移植存活和移行能力更强。
本研究对SCI模型造模后9d移植NSCs,此时急性炎症已消退,微环境进入修复阶段,有神经生长、营养因子的表达及微血管的形成,有利于移植细胞的存活。
同时,NSCs分泌的神经营养因子有利于轴突再生及突触形成。
观察BBB评分发现,NSCs医治组神经功能恢复明显好于损伤对照组,不同有统计学意义。
开展干细胞医治的挑战之一就是移植后干细胞的散布和归宿。
在中枢神经系统的不同病理、生理条件下,移植的NSCs有着不同的迁移和分化能力,对干细胞这一特性的研究目前多为在移植后的一按时间内处死实验动物,对神经组织进行切片。
而这些侵袭性的方式,不能对NSCs在同一动物体内的迁移、增殖情况进行动态的观察,故需要非侵袭的手腕来对移植入体内的NSCs进行监测。
MRI可以提供25~50μm的分辨率,接近单一细胞的水平,使其理论上可以用来对移植的细胞进行活体示踪。
应用新型的MRI对比剂SPIO标记NSCs,以其独特的超顺磁性,利用MRI可以对NSCs移植后的迁移、增殖情况进行动态观察。
SPIO为一种颗粒物质,是一种新型的MR细胞内对比剂。
作为超顺磁性MR对比剂,它可以影响局部磁场均匀性,同时产生磁化率效应(susceptibilityeffect),从而加速共振质子的失相位,使T2弛豫时间显著缩短,此类对比剂的T1效应相对较弱。
SPIO是由晶体氧化铁作为颗粒核心,用稳定剂如右旋糖酐(又名葡聚糖)或羧葡聚糖膜所包裹。
它主要通过以下3种机制选择性标记干细胞:
(1)直接胞吞作用:
将被葡聚糖包被的SPIO直接放入培育基中,与用于移植的NSCs一路培育,标记细胞。
(2)受体介导的胞吞作用:
在已进行的研究中,SPIO颗粒多与转铁蛋白共价结合,结合后的复合物放入培育基中和干细胞一路培育。
(3)转染试剂转染后介导的胞吞作用:
一种是阳离子物质转染后介导的胞吞作用,另一种是脂质体介导的胞吞作用。
本实验在NSCs移殖后3~5周行MRI检查SCI部位可观察到低信号改变。
表明NSCs可以定向地向损伤区域迁移,此时BBB评分显示细胞移殖医治组与损伤对照组有显著性不同,说明随着移殖细胞向SCI区域迁移数量的增加,大鼠运动功能也取得明显改善。
利用这种非侵袭的方式,对移植入体内的NSCs进行动态监测。
此项技术应用于临床,对移殖的干细胞进行标记,无创检测移殖的细胞在体内存活和迁移的情况,同时与功能评分相结合,可以对研究和医治对象进行实时、持续的观察。
随着干细胞移植技术的日趋成熟、干细胞标记技术研究的深切和MRI技术的迅速发展,可以预期该项研究将会对SCI的医治产生深远的影响,对神经康复医学及医学影像学的发展作出庞大的贡献。
【参考文献】
[1]GAGEFneuralstemcells[J].Science,2000,287(5457):
1433-1438.
[2]ARBABAS,BASHAWLA,MILLERBR,etofbiophysicalandmetabolicpropertiesofcellslabeledwithsuperparamagneticironexidenanoparticlesandtransfectionagentforcellularMRimaging[J].Radiology,2003,229:
838-846.
[3]唐少锋,汤逊,蔡景霞,等.人胚胎神经干细胞的分离培育及鉴定研究[J].中国脊柱脊髓杂志,2003,13(9):
523-525.
[4]KHANT,HAVEYRM,SAYERSST,etmodelsofspinalcordcontusioninjuries[J].LabAnimSci,1999,49:
161-172.
[5]BASSODM,BEATTIEMS,BRESNAHANJsensitiveandreliablelocomotorratingscaleforopenfieldtestinginrats[J].JNeurotrauma,1995,12:
1-21.
[6]REYONLDSBA,WEISSofneuronsandastrocytesfromisolatedcellsoftheadultmammaliancentralnervoussystem[J].Science,1992,255:
1707-1710.
[7]NAKAMURAM,HOUGHTLINGRA,MACARTHURL,etincytokinegeneexpressionprofilebetweenacuteandsecondaryinjuryinadultratspinalcord[J].ExpNeurol,2003,184(Ⅰ):
313-325.
[8]COUMANSJV,LINTT,DAIHN,etregenerationandfunctionalrecoveryaftercompletespinalcordtransactioninratsbydelayedtreatmentwithtransplantsandneurotrophins[J].JNeurosci,2001,21:
9334-9344.
[9]OKANOH,OGAWAY,NAKAMURAM,etofneuralstemcellsintothespinalcordafterinjury[J].SeminCellDevBiol,2003,14:
191-198.
[10]SUZUKIY,KITAURAM,WUS,etandhorseradishperoxidase-tracingstudiesofnerveregenerationthroughalginatelledgapinadultratspinalcord[J],NeurosciLetters,2002,318:
121-124.
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 神经 干细胞 移植 医治 大鼠 脊髓 损伤 活体 研究